lncRNA CYTOR/miR-193b-3p/HMGB1轴调控T细胞急性淋巴细胞白血病细胞MOLT-4增殖与凋亡的作用研究

杨春燕, 王海燕, 黄 倩, 程盼盼, 李 玲, 陈璐璐, 刘海惠, 张 顥

(济宁医学院附属医院 血液科, 山东 济宁, 272001)

T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是急性淋巴细胞白血病(ALL)的一种亚型，约占ALL的15 %[1]。目前，随着强化化疗方案的广泛应用, T-ALL患者预后结局均有所改善，但部分患者仍存在预后结局不佳的现象[2]。因此，亟需寻找治疗T-ALL的新方法。lncRNA CYTOR属于长链非编码RNA(lncRNA)家族成员，参与调控多种肿瘤细胞的恶性表型。研究[3]显示, lncRNA CYTOR在肝癌组织中表达增加，其通过竞争性吸附miR-125b-5p并上调KIAA1522的表达，促进肝癌细胞增殖和细胞周期进程，并阻碍肝癌细胞凋亡，促进肝癌的发展进程。lncRNA CYTOR在胰腺癌中表达升高，敲低lncRNA CYTOR可通过靶向miR-205-5p/CDK6轴阻碍体外胰腺癌细胞增殖和迁移，同时抑制体内肿瘤生长, lncRNA CYTOR可能是胰腺癌的潜在治疗靶点[4]。然而目前尚未有研究阐明lncRNA CYTOR对T-ALL细胞增殖、凋亡的影响与机制。

根据Starbase靶基因预测结果表明, lncRNA CYTOR或许与miR-193b-3p有靶向结合关系，高迁移率族蛋白1(HMGB1)可能是miR-193b-3p的靶基因。miR-193b-3p可通过靶向MYB抑制T-ALL细胞的恶性表型，为T-ALL的治疗提供了潜在靶点[5]。HMGB1是一种高度保守的蛋白质，其编码基因位于染色体13q12。HMGB1在ALL中的表达显著高于健康者，其可能通过诱导自噬、DNA损伤修复等方式促进ALL化疗耐药[6]。本研究主要观察了lncRNA CYTOR/miR-193b-3p/HMGB1轴对T-ALL细胞增殖和凋亡的影响，以期为该类患者提供新的靶向治疗依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人正常骨髓基质细胞系HS-5购于上海雅吉生物科技有限公司; T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)购于中国科学院上海细胞库; RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒购于大连宝生物; LipofectamineTM2000试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI购于北京索莱宝; 胎牛血清(FBS)购于浙江天杭生物科技股份有限公司; PCR引物、si-lncRNA CYTOR、si-HMGB1、si-NC、miR-193b-3p 模拟物和抑制剂、模拟对照序列和抑制剂阴性对照序列由上海生工公司合成; 兔抗人HMGB1、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase3)和β-actin抗体，购于中国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 将人正常骨髓基质细胞系HS-5和T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)复苏，均用含10% FBS的RPMI 1640培养液于普通培养箱中培养。当细胞生长密度为90%时，传代培养。

1.2.2 逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1mRNA表达: 将对数期HS-5和T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)均接种至6孔板中(1.0×105个/孔)，培养24 h。提取总RNA逆转录为cDNA后，行PCR扩增。引物序列: lncRNA CYTOR上游5′-AGAATGAAGGCTGAGGTGTG-3′, 下游5′-CAGCGACCATCCAGTCATTTA-3′; miR-193b-3p上游5′-AAAGTCCCGCTGTCGTA TCC-3′, 下游5′-GTATCCAGTGCGTGTCGTGG-3′;HMGB1上游5′-TATGGCAAAAGCGG ACAAGG-3′, 下游5′-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3′;GAPDH上游5′-GGAGCGAGATC CCTCCAAAAT-3′, 下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;U6上游5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′, 下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-△△Ct法计算lncRNA CYTOR和HMGB1mRNA相对GAPDH及miR-193b-3p相对U6的表达量。

1.2.3 细胞转染: 将处于对数生长期的MOLT-4细胞接种至6孔板中，以密度为1.0×105个/孔进行接种，孵育24 h后，采用LipofectamineTM2000脂质体法分别转染si-NC(si-NC组)、si-CYTOR(si-CYTOR组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-193b-3p mimics(miR-193b-3p组)、si-HMGB1(si-HMGB1组)，共转染si-CYTOR与anti-miR-NC(si-CYTOR+anti-miR-NC组)、共转染si-CYTOR与anti-miR-193b-3p(si-CYTOR+anti-miR-193b-3p组)、共转染si-CYTOR与pcDNA(si-CYTOR+pcDNA组)和共转染si-CYTOR与pcDNA-HMGB1(si-CYTOR+pcDNA-HMGB1组)。12 h后更换培养液，继续培养24 h后收集细胞，采用RT-qPCR法检测细胞中lncRNA CYTOR或miR-193b-3p表达，采用蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞中HMGB1蛋白表达。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖: 将“1.2.3”中转染后的细胞分别接种至96孔板中，以2.5×104个/孔的密度进行接种，在48 h后加入CCK-8 10 μL并继续培养2 h, 用波长为450 nm的酶标仪(λ=450 nm)测定光密度(OD)值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡: 将“1.2.3”中转染后细胞分别接种至6孔板中，以1.0×105个/孔的密度进行接种，并于48 h进行收集。加500 μL结合缓冲液，重悬细胞。再依次加入Annexin V-FITC与PI各5 μL, 混匀后静置10 min, 采用贝克曼FC500流式细胞仪及Cellauest软件对细胞凋亡情况进行检测。

1.2.6 Western blot检测HMGB1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3蛋白表达: 于6孔板中接种2.5 mL“1.2.3”中各组细胞悬液(5.0×104个/mL), 培养24 h后，将RIPA裂解液(400 μL)加入到收集到的细胞中，并对细胞总蛋白进行提取。采用BCA实验方法测定各组细胞胶原蛋白质的细胞浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE, 40 μg蛋白)后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。于4 ℃冰箱中，分别用稀释度均为1∶1 000的HMGB1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、β-actin一抗孵育过夜，洗膜后，再置于稀释度为1∶2 000的山羊抗兔二抗中，室温孵育1 h。1 h后向细胞内滴加ECL显影，应用Image J软件分析各分组细胞的总条带胶原蛋白细胞灰度的统计数值及HMGB1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3相对β-actin的表达量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验: 根据Starbase软件预测的结合位点，分别设计并合成lncRNA CYTOR、HMGB1的野生型荧光素酶载体(WT-CYTOR、WT-HMGB1)及突变型荧光素酶载体(MUT-CYTOR、MUT-HMGB1)。将MOLT-4细胞接种至6孔板中，以1.0×105个/孔的密度接种并培育24 h, 培育完毕采用LipofectamineTM2000脂质体法，转染miR-193b-3p mimics与WT-CYTOR或WT-HMGB1、miR-NC与WT-CYTOR或WT-HMGB1、miR-193b-3p mimics与MUT-CYTOR或MUT-HMGB1、miR-NC与MUT-CYTOR或MUT-HMGB1。12 h后更换培养液。继续培养24 h并裂解细胞。将裂解液放入离心机中，设置离心参数(3 500转/min离心5 min, 半径13.5 cm)后，检测上清荧光素酶活性，结果以萤火虫与海肾的荧光强度比值表示。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 T-ALL细胞系中lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1表达

与人正常骨髓基质细胞系HS-5比较, T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)中lncRNA CYTOR表达升高, miR-193b-3p表达降低,HMGB1mRNA及HMGB1蛋白表达升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。MOLT-4细胞各检测指标与HS-5细胞差异最显著，因此，选择MOLT-4细胞进行后续实验。见图1、表1。

表1 T-ALL细胞系中lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1表达

2.2 下调lncRNA CYTOR对T-ALL细胞系MOLT-4增殖和凋亡的影响

si-NC组和si-CYTOR组MOLT-4细胞中lncRNA CYTOR表达量分别为(1.00±0.05)、(0.22±0.03), 差异有统计学意义(t=40.13,P<0.05), 说明CYTOR干扰载体构建成功。与si-NC组相比, si-CYTOR组Bcl-2蛋白表达降低, Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05); 与si-NC组相比, si-CYTOR组MOLT-4细胞增殖活性降低，凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

表2 下调lncRNA CYTOR对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

2.3 上调miR-193b-3p对T-ALL细胞系MOLT-4增殖和凋亡的影响

miR-NC组、miR-193b-3p组MOLT-4细胞中miR-193b-3p表达量分别为(1.00±0.02)、(2.63±0.14), 差异有统计学意义(t=34.58,P<0.05), 说明过表达miR-193b-3p成功。与miR-NC组相比, miR-193b-3p组Bcl-2蛋白表达降低, Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05); 与miR-NC组相比, miR-193b-3p组MOLT-4细胞增殖活性降低，凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表3。

表3 上调miR-193b-3p对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

2.4 下调HMGB1对MOLT-4增殖和凋亡的影响

si-NC组、si-HMGB1组MOLT-4细胞中HMGB1蛋白表达量分别为(0.95±0.10)、(0.19±0.03), 差异有统计学意义(t=21.84,P<0.05), 说明HMGB1干扰载体构建成功。与si-NC组相比, si-HMGB1组的Bcl-2蛋白表达降低, Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05); 与si-NC组相比, si-HMGB1组MOLT-4细胞增殖活性降低，凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表4。

表4 下调HMGB1对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

2.5 lncRNA CYTOR靶向结合miR-193b-3p调控HMGB1表达

miR-193b-3p与lncRNA CYTOR、HMGB1的结合位点见图5A、5B。与共转染miR-NC与WT-CYTOR或WT-HMGB1的MOLT-4细胞比较，共转染miR-193b-3p mimics与WT-CYTOR或WT-HMGB1的MOLT-4细胞荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与共转染miR-NC与MUT-CYTOR或MUT-HMGB1的MOLT-4细胞比较，共转染miR-193b-3p mimics与MUT-CYTOR或MUT-HMGB1的MOLT-4细胞荧光素酶活性，差异无统计学意义(P>0.05), 见表5。此外, si-CYTOR组MOLT-4细胞中HMGB1蛋白表达量为(0.25±0.05), 低于si-NC组的(0.94±0.10), 差异有统计学意义(t=18.52,P<0.05);miR-193b-3p组MOLT-4细胞中HMGB1蛋白表达量为(0.21±0.03), 低于miR-NC组的(0.97±0.07), 差异有统计学意义(t=29.94,P<0.05), 见图5C。

表5 双荧光素酶活性检测结果

2.6 下调miR-193b-3p逆转lncRNA CYTOR敲低对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

si-CYTOR组、si-CYTOR+anti-miR-NC组、si-CYTOR+anti-miR-193b-3p组MOLT-4细胞中miR-193b-3p表达量分别为(2.22±0.21)、(2.20±0.17)、(0.95±0.09), 组间差异有统计学意义(F=176.22,P<0.05), 说明MOLT-4细胞中miR-193b-3p表达下调。相较于si-CYTOR组和si-CYTOR+anti-miR-NC组, si-CYTOR+anti-miR-193b-3p组MOLT-4细胞增殖活性及HMGB1、Bcl-2蛋白表达升高，而凋亡率和Bax、cleaved-caspase3蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。si-CYTOR组与si-CYTOR+anti-miR-NC组各检测指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图6、表6。

表6 下调miR-193b-3p逆转lncRNA CYTOR敲低对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

2.7 上调 HMGB1逆转lncRNA CYTOR敲低对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

与si-CYTOR组、si-CYTOR+pcDNA组比较, si-CYTOR+ pcDNA-HMGB1组中细胞增殖活性和HMGB1、Bcl-2蛋白水平升高，而细胞凋亡率、Bax、cleaved-caspase3蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7、表7。

表7 上调 HMGB1逆转lncRNA CYTOR敲低对MOLT-4细胞增殖和凋亡的影响

3 讨 论

T-ALL的发生发展受多种基因分子的调控，探究T-ALL中异常表达的基因及其相关机制，对发现新的治疗靶点具有重要意义。lncRNA和miRNA是不同的非编码RNA, lncRNA在miRNA分子海绵中进行调控，进而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡[7]。研究[8]显示, T-ALL发病过程由多种IncRNA共同参与。敲除lncRNA ARIEL可抑制体外T-ALL细胞增殖，并阻碍小鼠异种移植瘤生长; lncRNA ZFAS1可竞争性吸附miR-150, 进而上调ST6GAL1的表达促进T-ALL细胞对化疗药物阿霉素的耐药性[9]; lncRNA NEAT1在T-ALL细胞中表达升高，敲低其表达可抑制T-ALL细胞增殖，其作用机制与靶向miR-146b-5p/NOTCH1轴有关[10]。T-ALL中异常表达的lncRNA为其治疗提供潜在靶点。

lncRNA CYTOR作为lncRNA的一种类型，能够对不同肿瘤的恶性表型及耐药性进行调控。研究[11]显示, lncRNA CYTOR可通过靶向miR-195促进非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和侵袭，并诱导NSCLC细胞的放射抗性，其有可能被用作NSCLC治疗的分子靶点; lncRNA CYTOR在耐他莫昔芬的乳腺癌组织中呈高表达，其可增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性[12]。本研究结果显示, lncRNA CYTOR在T-ALL细胞系中的表达显著高于人正常骨髓基质细胞系HS-5, 提示其可能也促进T-ALL的发展进程; 通过下调T-ALL细胞系中lncRNA CYTOR表达发现，下调lncRNA CYTOR可有效降低T-ALL细胞系增殖活性，并诱导其凋亡，这提示lncRNA CYTOR也有可能成为T-ALL治疗的分子靶点。

本研究结果显示, Bax/Bcl-2能够调控细胞凋亡。正常生理状态下, Bcl-2与Bax形成异源二聚体，抑制Bax的功能。当Bcl-2表达减少时, Bax被释放，通过BH3结构域形成同源二聚体，增加线粒体膜的通透性，并将细胞色素C释放于细胞质，产生诱导细胞凋亡的作用[13]。此外下调lncRNA CYTOR, T-ALL细胞系中Bcl-2蛋白表达减少, Bax蛋白表达增加，提示lncRNA CYTOR可能通过间接调控Bax/Bcl-2影响T-ALL细胞系凋亡。

本研究证实了lncRNA CYTOR可竞争性吸附miR-193b-3p, 且下调lncRNA CYTOR可促进T-ALL细胞系中miR-193b-3p的表达。miR-193b-3p作为miRNA的一员，对多种肿瘤的发展过程具有重要作用。研究[14-17]显示, miR-193b-3p在舌鳞状细胞癌、胃癌等肿瘤中呈低表达，上调miR-193b-3p可抑制肿瘤细胞的恶性表型。本研究显示, miR-193b-3p在T-ALL细胞中表达显著较低，上调miR-193b-3p可有效阻碍T-ALL细胞增殖，并诱导其凋亡，这提示miR-193b-3p对T-ALL的发展起抑制作用; 此外，下调miR-193b-3p可逆转下调lncRNA CYTOR对T-ALL细胞系增殖的抑制作用及凋亡促进作用，这提示lncRNA CYTOR可能通过竞争性吸附miR-193b-3p来调控T-ALL细胞系增殖和凋亡。

HMGB1属于细胞核内的一种非组蛋白染色体结合蛋白，在哺乳动物组织及细胞中普遍存在，参与足细胞分化、迁移及肿瘤耐药等多种生理或病理过程。研究[18]显示，过表达miR-142-3p可通过靶向抑制HMGB1增强乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性, miR-142-3p/HMGB1轴可能为改善乳腺癌耐药性提供了新靶点。miR-1179的过表达可通过靶向抑制HMGB1阻碍胃癌细胞增殖和侵袭[19]; lncRNA DSCAM-AS1可通过竞争性吸附miR-577, 上调HMGB1的表达促进NSCLC细胞增殖和侵袭，进而促进NSCLC的发展进程[20]。HMGB1在白血病中的作用也被广泛关注。研究[21]显示, HMGB1在ALL患者血清中呈高表达，且与患者分期及分型密切相关; 复发ALL患者血清中HMGB1水平显著高于完全缓解患者，血清HMGB1水平可作为ALL预后评估的生物学标志物[22]。本研究结果显示, T-ALL细胞系中HMGB1呈高表达，下调其表达可抑制T-ALL细胞系增殖，并促进细胞凋亡，说明HMGB1促进T-ALL的发展进程，提示其可作为T-ALL的治疗靶点。同时，本研究结果显示，下调lncRNA CYTOR或上调miR-193b-3p均可抑制T-ALL细胞系中HMGB1蛋白表达，而下调miR-193b-3p逆转了下调lncRNA CYTOR对T-ALL细胞系中HMGB1蛋白表达的抑制作用，进一步说明lncRNA CYTOR可靶向miR-193b-3p正向调控HMGB1表达，提示其通过靶向miR-193b-3p/HMGB1轴来影响T-ALL细胞系增殖和凋亡。

综上所述, lncRNA CYTOR在T-ALL细胞系中的表达明显升高，下调其表达可有效阻碍T-ALL细胞系增殖，并诱导细胞凋亡，其可能通过靶向miR-193b-3p/HMGB1轴发挥作用，或可成为治疗T-ALL的分子靶点。