缬草水提取物的化学成分研究

吴肸乐，李 冉，李世伟，张丽花，韩立峰，张 祎，王 涛，王少峡，吴红华

缬草水提取物的化学成分研究

吴肸乐1，李 冉1，李世伟1，张丽花1，韩立峰1，张 祎1，王 涛1，王少峡2，吴红华1*

1. 天津中医药大学中医药研究院 组分中药国家重点实验室，天津 301617 2. 天津中医药大学中西医结合学院，天津 301617

对缬草水提取物中的化学成分进行研究。运用正相硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、制备高效液相色谱等分离手段进行分离纯化，采用核磁共振、质谱等多种波谱学技术鉴定化合物的化学结构，并采用Griess法评价其对脂多糖诱导的小胶质细胞BV-2神经炎症的抑制活性。从缬草水提取物中分离得到了12个化合物，分别为tinnevellin-8--β--glucopyranoside（1）、大黄素-8-β--吡喃葡萄糖苷（2）、(2,3)-肥牛木素（3）、左旋橄榄素-9--β--吡喃葡萄糖苷（4）、左旋马尾松树脂醇-3a--β--吡喃葡萄糖苷（5）、金色酰胺醇乙酸酯（6）、松脂素（7）、8-羟基松脂素（8）、松脂素-4-β--吡喃葡萄糖苷（9）、8,8-二羟基松脂素-4-β--吡喃葡萄糖苷（10）、(2)-橙皮苷（11）和香蜂草苷（12）。化合物1～4和6均为首次从缬草属植物中分离得到。其中，化合物3～4、6、9、11～12在不影响BV-2的细胞活力前提下，可以抑制脂多糖诱导的BV-2细胞神经炎性因子一氧化氮（NO）的产生。

缬草；萘酚苷；木脂素；大黄素-8-β--吡喃葡萄糖苷；(2,3)-肥牛木素；左旋橄榄素-9--β--吡喃葡萄糖苷；金色酰胺醇乙酸酯

缬草L.为忍冬科（Caprifoliaceae）缬草属Linn.多年生草本植物[1]，主要分布于我国东北、西南及西北地区[2]。缬草以干燥根及根茎入药，根茎呈头状或短柱状，质坚实，不易折断，有特殊气味，一般秋季采挖，去除地上部分及泥沙，洗净，闷润，切厚片，干燥后即可药用[3]。缬草是全世界范围内被广泛应用的传统草药之一，最早被古希腊人用于治疗泌尿及胃肠消化道紊乱，至19世纪被广泛用于治疗女性神经系统疾病，有“19世纪的安定”之称[4]。在我国，早在唐朝《新修本草》中就有缬草的记载，其味辛、苦，性温，归心、肝经，具有安神、理气、止痛之功效，中医临床多配伍诸药用于治疗神经衰弱、失眠、癔病、脘腹胀痛、腰腿痛和跌打损伤等[5]。此外，缬草是一种温和的镇静剂和促睡眠剂，安全，不良反应小，在欧洲等地区一直作为镇静剂使用，已有多个世纪的历史。缬草干燥根或根的提取物制成片剂或软胶囊，可作为膳食补充剂使用[6]。缬草富含挥发油成分，植物化学研究发现缬草除含环烯醚萜等主要成分之外，还含有木脂素、黄酮、生物碱及氨基酸等其他类成分[5]。现代药理研究表明缬草在镇静、抗抑郁、抗癫痫、改善认知能力、解痉、调节血脂、抗脂质过氧化、保护肾脏以及防治胆囊结石和心脑血管系统疾病等方面均有显著作用[7]。

本研究报道缬草水提取物的化学成分分离及结构鉴定，从中分离并鉴定出12个化合物，分别为tinnevellin-8--β--glucopyranoside（1）、大黄素- 8--β--吡喃葡萄糖苷（emodin-8--β--gluco- pyranoside，2）、(2,3)-肥牛木素 [(2,3)- ceplignan，3]、左旋橄榄素-9--β--吡喃葡萄糖苷 [(−)-olivil-9--β--glucopyranoside，4]、左旋马尾松树脂醇-3a--β--吡喃葡萄糖苷 [(−)- massoniresinol-3a--β--glucopyranoside，5]、金色酰胺醇乙酸酯（aurantiamide acetate，6）、松脂素（pinoresinol，7）、8-羟基松脂素（8-hydroxy- pinoresinol，8）、松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷（pinoresinol-4--β--glucopyranoside，9）、8,8-二羟基松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷（prinsepiol- 4--β--glucopyranoside，10）、(2)-橙皮苷 [(2)- hesperidin，11] 和香蜂草苷（didymin，12）。其中，化合物1～4和6均为首次从缬草属植物中分离得到。化合物3～4、6、9、11～12在不影响小胶质细胞BV-2的细胞活力前提下，能够抑制脂多糖诱导的BV-2细胞神经炎性因子一氧化氮（NO）的产生。

1 仪器与材料

MS105DU/A十万分之一电子天平（上海梅特勒–托利多有限公司）；DLSB型低温冷却液循环泵（巩义市英峪予华仪器有限责任公司）；EYELA-DPE-2150旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；BUCH-R-215旋转蒸发仪（瑞士步琪有限公司）；SHZ-(DIII) 循环水式多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；TH-II型薄层加热器（上海科哲生化科技有限公司）；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；Agilent 1260 II型分析高效液相（美国Agilent公司）；岛津Prominence制备型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SHIM-PACK PRC-ODS(H) 制备型色谱柱（20.0 mm×25 cm，日本岛津公司）；Bruker AV-III 600 MHz/500 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）；静电场轨道阱超高分辨液质联用仪UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS（美国Thermo Fisher Scientific公司）；二氯甲烷、正丁醇、醋酸乙酯、甲醇等试剂的色谱及分析级（天津市康科德化学试剂厂）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；GF254薄层色谱硅胶板（10 cm×20 cm）和GF254薄层制备硅胶板（20 cm×20 cm，于成化工有限公司）；反相ODS C18柱填料（日本YMC公司）；D101大孔吸附树脂（天津海光化工有限公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（瑞士GE Healthcare公司）。小鼠BV-2小胶质细胞株（中国医学科学院基础研究所）；DMEM培养基、胰酶、胎牛血清、青霉素、链霉素、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒（北京同仁化学公司）；NO检测试剂盒（上海碧云天公司）；米诺环素（北京索莱宝公司）；Forma 3111型CO2恒温培养箱、酶标仪（美国Thermo公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

本课题研究用缬草药材购自河北安国药材市场（样本编号201907140185），经天津中医药大学中药学院李天祥教授鉴定为忍冬科缬草属植物缬草L.的干燥根及根茎。该药材的水提取物粉末（批号ZDV190418）由西安正东生物科技有限公司代提取并干燥获得所有标本及样本现存放于天津中医药大学中医药研究院药学部。

2 方法

2.1 提取与分离

缬草水提取物800.0 g，4 L纯水复溶后用等体积的醋酸乙酯萃取4次，合并4次萃取液，减压浓缩回收溶剂后干燥得醋酸乙酯萃取部位8.2 g。剩余水溶液减压浓缩后经冷冻干燥得水溶性部位786.0 g。醋酸乙酯萃取部位进一步经硅胶（200～300目）柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（100∶0、50∶50、30∶70、0∶100）洗脱，薄层色谱检识合并，得到15个精细组分（E1～E15）。水溶性部位通过D101大孔树脂（水、95%乙醇洗脱）得到水洗脱类组分513.0 g和95%乙醇洗脱类组分111.4 g。95%乙醇洗脱类组分用纯水（600 mL）溶解后，调pH至4.05，等体积正丁醇萃取3次，浓缩干燥得到正丁醇萃取物7.4 g，进一步经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（85%甲醇）分离，获得11个精细组分B1～B11。精细组分E11经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）、ODS开放柱色谱（甲醇-纯水10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0），再经制备型HPLC（25%、36%和25%乙腈，体积流量6 mL/min）纯化得化合物1（1.1 mg，R＝10.6 min）、2（1.1 mg，R＝18.2 min）和9（1.0 mg，R＝18.5 min）。精细组分E9（0.2 g）经ODS开放柱色谱，甲醇-纯水（10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0）洗脱后经制备薄层色谱（二氯甲烷-甲醇10∶1）进一步纯化得到化合物3（1.5 mg）。精细组分B5（560.0 mg）经ODS开放柱色谱甲醇-纯水（10%、30%、50%、70%和100%）洗脱后经制备型HPLC（56%乙腈，体积流量6 mL/min）得化合物4（1.0 mg，R＝40.0 min）、5（20.0 mg，R＝48.0 min）和10（14.0 mg，R＝52.0 min）。精细组分B3（1.5 g）经ODS开放柱色谱甲醇-纯水（10%、30%、50%、70%和100%）洗脱后经制备型HPLC（55%乙腈，体积流量6 mL/min）得化合物6（2.2 mg，R＝24.7 min）。精细组分E6（0.4 g）经ODS开放柱色谱，甲醇-纯水（10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0）洗脱后通过制备型HPLC（40%乙腈，体积流量6 mL/min）得到化合物7（1.0 mg，R＝11.5 min）。精细组分E5（2.6 g），采用硅胶（200～300目）开放柱色谱二氯甲烷-甲醇（100∶0、50∶50、30∶70、0∶100）洗脱后经制备型HPLC（42%乙腈，体积流量6 mL/min）制备得化合物8（3.2 mg，R＝15.2 min）。精细组分E13（0.5 g）和E14（1.1 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱甲醇洗脱除色素后合并，再经ODS开放柱色谱，甲醇-水（10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、100∶0）洗脱，最后经制备型HPLC（29%、33%乙腈，体积流量6 mL/min）纯化得化合物11（10.1 mg，R＝13.5 min）和12（6.5 mg，R＝28.1 min）。

2.2 LPS诱导的小胶质细胞炎症的评价

缬草为忍冬科缬草属多年生草本植物，药理研究报道其具有一定的抗抑郁作用[8]。抑郁症可能是一种“小胶质细胞疾病”，因为小胶质细胞激活是神经炎症的特征性改变，与抑郁症的发生、发展密切相关[9-10]。因此，本研究利用LPS诱导的小胶质细胞炎症模型，使用Griess法[11]考察所分离得到的化合物对LPS诱导的BV-2细胞炎性因子NO含量的影响，评价其抑制神经炎症的活性。取缬草化合物适量溶于DMSO中（储存浓度10 mmol/L）待用。BV-2细胞于DMEM＋10%FBS＋1%双抗培养液中，置于5%CO2、95%空气、37 ℃饱和湿度的培养箱中，每隔1 d用胰酶消化传代（1∶6）培养。

2.2.1 待测化合物对LPS诱导BV-2细胞活力的影响 设对照组、模型组、阳性药组及药物处理组。取对数期生长细胞，接种在48孔板中（4×105个/ mL，400 μL/孔）于37 ℃，5% CO2培养箱过夜，对照组加入含0.1% DMSO的基础培养基，模型组加入LPS（终质量浓度为0.1 μg/mL），阳性药组同时加入LPS和米诺环素（终浓度为10 μmol/L），药物处理组同时加入LPS和配制好的待测化合物（终浓度为10 μmol/L），24 h后弃去上清加入含10 % CCK-8的培基（400 μL/孔），37 ℃孵箱中孵育30 min，用酶标仪于450 nm 处读取吸光度（）值，考察待测化合物对LPS诱导小胶质细胞活力的影响。

2.2.2 待测化合物对LPS诱导小胶质细胞分泌NO的影响 设对照组、模型组、阳性药组及药物处理组。取对数生长期细胞，接种在48孔板中（4×105个/mL，400 μL/孔）于37 ℃、5% CO2培养箱孵育过夜，过夜后对照组和模型组用基础培基孵育，阳性药组和药物处理组用相应药物处理，各组均先预孵育30 min，30 min后对照组加入0.1%的DMSO，模型组加入LPS（终质量浓度为0.1 μg/mL），阳性药组同时加入LPS和米诺环素（终浓度为10 μmol/L），药物处理组同时加入LPS和配制好的待测化合物（终浓度为10 μmol/L），24 h后按照NO试剂盒说明书进行操作，测定540 nm波长处值，代入相应标准曲线（＝128.19－6.799 5，2＝0.998）计算NO浓度。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1：无色油状物，10%硫酸-乙醇溶液显绿色。[α]25 D-39.2 (0.05, MeOH)；CD (0.05, MeOH)λ(Δε): 194.8 (＋3.61), 202.8 (＋2.60), 230.5 (＋6.89)；HR-ESI-MS在/409.148 5 [M＋H]+（计算值409.149 3，C20H25O9）处给出准分子离子峰，结合1D-NMR数据，提示其分子式为C20H24O9，不饱和度为9。红外光谱显示有甲基（C-H2919 cm−1和2854 cm−1）、芳环（1594 cm−1和1628 cm−1）和糖上醚键（C-O-C1076 cm−1）的特征吸收峰。UVmax(MeOH) nm(log):238.3(2.80)、250.0(1.60)、280.0(0.40)、336.9(0.60)。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.04 (1H, s, H-4), 6.97 (1H, d,= 2.1 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,= 2.1 Hz, H-7), 5.03 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 4.08 (3H, s, H3-1), 3.95 (1H, dd,= 12.0, 2.2 Hz, H-6a), 3.71 (1H, dd,= 12.1, 6.2 Hz, H-6b), 3.54 (1H, m, H-5), 3.50 (2H, m, H-2, 3), 3.39 (1H, ddd,= 9.2, 6.3, 2.8 Hz, H-4), 2.59 (3H, s, H3-10), 2.29 (3H, s, H3-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 207.9 (C=O), 159.2 (C-8), 158.5 (C-6), 154.2 (C-1), 139.0 (C-4a), 135.7 (C-3), 124.0 (C-2), 120.5 (C-4), 110.6 (C-8a), 105.0 (C-5), 102.3 (C-1), 99.3 (C-7), 78.4 (C-5), 78.0 (C-3), 74.9 (C-2), 71.5 (C-4), 62.6 (C-6), 57.0 (C-1), 32.5 (C-10), 20.2 (C-11)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物1为tinnevellin-8--β--glucopyranoside。

化合物2：黄色无定形粉末，分子式为 C21H20O10。(-)-HR-ESI-MS/431.098 3 [M－H]−（计算值431.098 4，C21H19O10）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.52 (1H, s, H-4), 7.30 (1H, s, H-5), 7.07 (1H, s, H-2), 7.01 (1H, s, H-7), 4.95 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.95 (1H, dd,= 12.0, 1.8 Hz, H-6a), 3.77 (1H, dd,= 12.0, 4.8 Hz, H-6b), 3.64 (1H, dd,= 9.0, 7.8 Hz, H-2), 3.53 (1H, t,= 9.0 Hz, H-3), 3.51 (1H, m, H-5), 3.47 (1H, t,= 9.0 Hz, H-4), 2.42 (3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 188.4 (C-9), 184.5 (C-10), 163.7 (C-1), 163.5 (C-6), 163.5 (C-8), 148.2 (C-3), 138.1 (C-10a), 134.2 (C-4a), 125.2 (C-2), 120.6 (C-4), 116.3 (C-9a), 113.5 (C-8a), 113.4 (C-5), 112.2 (C-7), 104.4 (C-1), 78.7 (C-5), 77.4 (C-3), 74.8 (C-2), 71.2 (C-4), 62.5 (C-6), 21.9 (C-11)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物2为大黄素-8--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物3：白色无定形粉末，分子式为 C18H18O7。[α]25 D＋32.0 (0.05, MeOH)；CD (0.01, MeOH)λ(Δε): 213.7 (＋3.02), 228.6 (-5.70), 259.3 (＋4.00), 277.8 (＋1.31), 293.2 (＋2.35)。(＋)-HR- ESI-MS/347.111 8 [M＋H]+（计算值347.112 5，C18H19O7）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.57 (1H, d,= 1.1 Hz, H-6), 7.52 (1H, s, H-4), 6.95 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.83 (1H, dd,= 8.2, 1.9 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 5.61 (1H, d,= 6.0 Hz, H-2), 3.89 (3H, s, 7-OCH3), 3.87 (2H, m, H-9), 3.81 (3H, s, 3-OCH3), 3.52 (1H, dt,= 11.2, 5.9 Hz, H-3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 174.4 (C-8), 151.5 (C-7a), 149.1 (C-3), 147.6 (C-4), 144.6 (C-7), 134.6 (C-1), 132.8 (C-5), 129.0 (C-3a), 119.80 (C-4), 119.77 (C-6), 116.2 (C-5), 115.2 (C-6), 110.5 (C-2), 89.8 (C-2), 64.9 (C-9), 56.5 (7-OCH3), 56.4 (3-OCH3), 55.1 (C-3)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物3为 (2,3)-肥牛木素。

化合物4：黄色无定形粉末，分子式为C26H34O12。[α]25 D-12.0 (0.05, MeOH)。(-)-HR-ESI- MS/537.198 0 [M－H]−（计算值537.197 8，C26H33O12）。1H-NMR (600 MHz, D2O): 7.20 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.00 (1H, d,= 7.8 Hz, H-6), 6.97 (1H, s, H-2), 6.89 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5), 6.88 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5), 6.83 (1H, d,= 7.8 Hz, H-6), 4.81 (1H, d,= 7.8 Hz, H-7), 4.44 (1H, d,= 8.4 Hz, H-1"), 4.11 (1H, m, H-9a), 3.97 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9a), 3.91 (1H, d,= 7.5 Hz, H-6"a), 3.90 (1H, dd,= 12.6, 7.2 Hz, H-9b), 3.88 (3H, s, 3-OCH3), 3.87 (3H, s, 3-OCH3), 3.71 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-9b), 3.70 (1H, d,= 9.6 Hz, H-6"b), 3.48 (1H, t,= 9.0 Hz, H-3"), 3.43 (1H, m, H-5"), 3.38 (1H, t,= 9.0 Hz, H-4), 3.29 (1H, t,= 9.0 Hz, H-2"), 3.07 (1H, d,= 14.0 Hz, H-7a), 2.99 (1H, d,= 14.0 Hz, H-7b), 2.61 (1H, q,= 6.8 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, D2O): 150.7 (C-3), 150.1 (C-3), 148.9 (C-4), 146.9 (C-4), 135.4 (C-1), 132.2 (C-1), 126.1 (C-6), 123.4 (C-6), 118.4 (C-5), 118.3 (C-5), 117.7 (C-2), 114.2 (C-2), 105.6 (H-1), 87.2 (C-7), 84.2 (C-8), 79.2 (C-9), 78.8 (C-3), 78.5 (C-5"), 76.0 (C-2), 72.6 (C-4), 70.6 (C-9), 63.6 (C-6), 60.3 (C-8), 58.9 (3-OCH3), 58.8 (3-OCH3), 41.7 (C-7)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物4为左旋橄榄素-9--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物5：黄色无定形粉末，分子式为C26H34O13。[α]25 D-11.8 (0.78, MeOH)。(＋)-HR-ESI- MS/555.207 0 [M＋H]+（计算值555.207 2，C26H35O13）。1H-NMR (600 MHz, D2O): 7.08 (1H, s, H-2), 7.01 (1H, d,= 1.3 Hz, H-2), 6.93 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.92 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5), 6.91 (1H, d,= 2.4 Hz, H-6), 6.85 (1H, dd,= 8.2, 1.3 Hz, H-6), 5.16 (1H, s, H-2), 4.50 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 4.18 (1H, d,= 10.8 Hz, H-3aa), 3.97 (1H, d,= 9.6 Hz, H-5a), 3.94 (1H, dd,= 9.0, 1.8 Hz, H-3ab), 3.92 (1H, m, H-6a), 3.89 (3H, s, 3-OCH3), 3.88 (3H, s, 3-OCH3), 3.76 (1H, m, H-5b), 3.74 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-6b), 3.53 (1H, t,= 9.0 Hz, H-3), 3.48 (1H, ddd,= 8.2, 6.0, 2.1 Hz, H-5), 3.41 (1H, t,= 9.6 Hz, H-4), 3.36 (1H, t,= 9.6 Hz, H-2), 3.03 (1H, d,= 14.4 Hz, H-4aa), 2.95 (1H, d,= 14.4 Hz, H-4ab)；13C-NMR (150 MHz, D2O): 150.0 (C-3), 149.99 (C-3), 147.8 (C-4), 146.7 (C-4), 132.3 (C-1), 131.9 (C-1), 126.3 (C-6), 123.7 (C-6), 118.2 (C-5), 117.9 (C-5), 117.8 (C-2), 115.0 (C-2), 105.6 (C-1), 87.4 (C-2), 84.3 (C-4), 83.5 (C-3), 78.9 (C-5), 78.5 (C-3), 76.0 (C-2), 75.1 (C-5), 73.9 (C-3a), 72.6 (C-4), 63.6 (C-6), 58.8 (3, 3-OCH3), 41.5 (C-4a)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物5为左旋马尾松树脂醇-3a--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物6：白色无定形粉末，分子式为C27H28N2O4。(＋)-HR-ESI-MS/445.211 2 [M＋H]+（计算值445.212 2，C27H29N2O4）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.72 (2H, dd,= 8.3, 1.2 Hz, H-3, 7), 7.53 (1H, t,= 7.2, 1.2 Hz, H-5), 7.44 (2H, t,= 7.7 Hz, H-4, 6), 7.11～7.26 (10H, overlapped, H-5, 6, 7, 8, 9,5～9), 4.78 (1H, m, H-2), 4.31 (1H, m, H-2), 3.98 (1H, dd,= 11.2, 4.4 Hz, H-1a), 3.91 (1H, dd,= 11.2, 6.1 Hz, H-1b), 3.13 (1H, dd,= 13.7, 6.8 Hz, H-3a), 2.99 (1H, dd,= 13.7, 8.4 Hz, H-3b), 2.85 (1H, dd,= 13.8, 6.7 Hz, H-3a), 2.79 (1H, dd,= 13.8, 7.9 Hz, H-3b), 2.01 (3H, s, 1OCOCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 173.3 (1OCO), 172.6 (C-1), 169.9 (C-1), 138.9 (C-4), 138.5 (C-4), 135.3 (C-2), 132.9 (C-5), 130.4 (C-6, 8), 130.3 (C-6, 8), 129.51 (C-46), 129.48 (C-5, 9, 5, 9), 128.5 (C-3, 7), 127.8 (C-7), 127.5 (C-7), 66.1 (C-1), 56.6 (C-2), 51.2 (C-2), 39.0 (C-3), 38.1 (C-3), 20.7 (1OCOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物6为金色酰胺醇乙酸酯。

化合物7：白色无定形粉末，分子式为C20H22O6。(-)-HR-ESI-MS/357.133 3 [M－H]−（计算值357.134 4，C20H21O6）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.05 (2H, d,= 1.8 Hz, H-2, 2), 6.85 (2H, dd,= 8.4, 1.8 Hz, H-6, 6), 6.78 (2H, d,= 8.4 Hz, H-5, 5), 4.97 (2H, s, H-7, 7), 4.10 (2H, d,= 9.6 Hz, H-9, 9), 3.98 (2H, d,= 9.6 Hz, H-8, 8), 3.86 (6H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 148.7 (C-3, 3), 147.5 (C-4, 4), 129.6 (C-1, 1), 121.6 (C-6, 6), 116.3 (C-8, 8), 115.6 (C-5, 5), 112.9 (C-2, 2), 89.1 (C-7, 7), 76.7 (C-9, 9), 56.4 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[18-19]，故鉴定化合物7为松脂素。

化合物8：白色无定形粉末，分子式为C20H22O7。[α]25 D＋33.0 (0.10, MeOH)。(＋)-HR-ESI- MS/375.142 9 [M＋H]+（计算值375.143 8，C20H23O7）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.05 (2H, d,= 2.0 Hz, H-2, 2), 6.87 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6), 6.85 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6), 6.78 (2H, d,= 8.4 Hz, H-5, 5), 4.84 (1H, s, H-7), 4.68 (1H, s, H-7), 4.46 (1H, dd,= 9.1, 8.2 Hz, H-8), 4.04 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9a), 3.87 (3H, s, -OCH3), 3.86 (3H, s, -OCH3), 3.86 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9b), 3.76 (1H, dd,= 9.0, 6.0 Hz, H-9a), 3.04 (1H, dt,= 8.2, 5.8 Hz, H-9b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 149.1 (C-3), 148.7 (C-3), 147.5 (C-4), 147.4 (C-4), 133.6 (C-1), 129.1 (C-1), 121.6 (C-6), 120.5 (C-6), 116.0 (C-5), 115.7 (C-5), 112.8 (C-2), 111.3 (C-2), 92.8 (C-8), 89.3 (C-7), 87.8 (C-7), 76.1 (C-9), 72.0 (C-9), 62.4 (C-8), 56.39 (-OCH3), 56.38 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物8为8-羟基松脂素。

化合物9：白色无定形粉末，分子式为 C26H32O11。(＋)-HR-ESI-MS/521.203 2 [M＋H]+（计算值521.201 7，C26H33O11）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.15 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 7.03 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 6.95 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2), 6.92 (1H, dd,= 8.4, 1.8 Hz, H-5), 6.81 (1H, dd,= 8.1, 1.8 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 4.88 (1H, d,= 7.5 Hz, H-1″), 4.76 (1H, d,= 4.0 Hz, H-7), 4.71 (1H, d,= 4.0 Hz, H-7), 4.23～4.27 (2H, m, H-9), 3.85～3.88 (2H, m, H-9), 3.87 (3H, s, 3-OCH3), 3.86 (3H, s, 3-OCH3), 3.69 (1H, dd,= 11.5, 3.6 Hz, H-6a), 3.52～3.44 (2H, m, H-2″, 3″), 3.39 (1H, m, H-6b), 3.39 (1H, d,= 6.8 Hz, H-8), 3.14 (1H, d,= 4.4 Hz, H-8), 3.14 (2H, m, H-4″, 5″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 151.0 (C-3), 149.1 (C-3), 147.5 (C-4), 147.4 (C-4), 137.5 (C-1), 133.8 (C-1), 120.1 (C-5), 119.8 (C-5), 118.0 (C-6), 116.1 (C-6), 111.6 (C-2), 111.0 (C-2), 102.9 (C-1"), 87.5 (C-7), 87.1 (C-7), 74.9 (C-3"), 55.5 (C-8), 55.4 (C-8), 78.2 (C-2"), 77.9 (C-4"), 72.73 (C-9), 72.68 (C-9), 71.3 (C-5"), 62.5 (C-6"), 56.7 (-OCH3), 56.4 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物9为松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物10：白色无定形粉末，分子式为C26H32O13。[α]25 D-60.0 (0.73, MeOH)。(-)-HR-ESI- MS/551.177 0 [M－H]−（计算值551.177 0，C26H31O13）。1H-NMR (600 MHz, D2O): 7.22 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 7.16 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.10 (1H, s, H-2), 7.04 (1H, dd,= 8.4, 1.6 Hz, H-6), 6.95 (2H, s, H-5, 6), 5.20 (1H, s, H-7), 5.16 (1H, s, H-7), 5.15 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1″), 4.27 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9a), 4.26 (1H, d,= 9.6 Hz, H-9b), 4.05 (2H, d,= 9.6 Hz, H-9), 3.93 (1H, dd,= 12.0, 2.4 Hz, H-6″b), 3.91 (3H, d,= 12.8 Hz, 3-OCH3), 3.89 (3H, d,= 12.8 Hz, 3-OCH3), 3.76 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-6″a), 3.61～3.65 (3H, m, H-3″～5″), 3.52 (1H, t,= 9.0 Hz, H-2″)；13C-NMR (150 MHz, D2O): 151.4 (C-3), 150.3 (C-3), 148.3 (C-4), 148.2 (C-4), 134.0 (C-1), 130.7 (C-1), 123.3 (C-6), 122.9 (C-6), 118.5 (C-5), 118.2 (C-5), 114.6 (C-2), 114.5 (C-2), 103.3 (C-1″), 90.8 (C-8), 90.7 (C-8), 90.0 (C-7), 89.8 (C-7), 79.0 (C-3″), 78.4 (C-5″), 77.4 (C-9), 77.3 (C-9), 75.7 (C-4″), 72.2 (C-2″), 63.4 (C-6″), 58.80 (3-OCH3), 58.76 (3-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[5]，故鉴定化合物10为8,8-二羟基松脂素- 4--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物11：黄色无定形粉末，分子式为C28H34O15。[α]25 D-37.2 (0.50, MeOH)；CD (0.02, MeOH)λ(Δε): 331.9 (-1.71), 238.8 (＋0.50), 209.9 (＋4.50), 193.2 (＋7.29), 289.8 (＋3.62), 222.3 (-1.42), 202.6 (＋0.19)。(＋)-HR-ESI-MS/611.195 7 [M＋H]+（计算值611.197 0，C28H35O15）。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.01 (1H, s, 5-OH), 9.09 (1H, s, 3-OH), 6.95 (1H, d,= 8.3 Hz, H-6), 6.93 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.90 (1H, d,= 8.3, 1.9 Hz, H-5), 6.14 (1H, m, H-6), 6.12 (1H, m, H-8), 5.49 (1H, dd,= 12.3, 3.0 Hz, H-2), 4.98 (1H, t,= 7.7 Hz, H-1), 4.51 (1H, s, H-1), 3.77 (3H, s, 4-OCH3), 3.14 (1H, dd,= 18.3, 5.2 Hz, H-3a), 2.76 (1H, dd,= 17.0, 3.0 Hz, H-3b), 1.09 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 197.1 (C-4), 165.1 (C-7), 163.0 (C-5), 162.6 (C-9), 148.0 (C-4), 146.5 (C-3), 131.0 (C-1), 118.0 (C-6), 114.2 (C-5), 112.1 (C-2), 103.3 (C-10), 100.6 (C-1), 99.4 (C-1), 96.4 (C-6), 95.6 (C-8), 78.4 (C-2), 76.3 (C-3), 75.5 (C-5), 73.0 (C-2), 72.1 (C-4), 70.7 (C-3), 70.3 (C-2), 69.6 (C-4), 68.3 (C-5), 66.1 (C-6), 55.6 (-OCH3), 42.2 (C-3), 17.8 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[22-25]，故鉴定化合物11为 (2)-橙皮苷。

化合物12：黄色无定形粉末，分子式为C28H34O14。[α]25 D-42.7 (0.52, MeOH)；CD (0.06, MeOH)(Δε): 305.0 (-0.12), 244.0 (-0.02), 224.2 (＋0.48), 203.5 (＋0.17), 286.0 (-0.58), 235.6 (-0.18), 216.0 (＋0.54), 195.1(＋0.84)。(＋)-HR-ESI-MS/595.2013 [M＋H]+（计算值595.202 1，C28H35O14）。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 12.01 (1H, s, 5-OH), 7.47 (2H, m, H-2, 6), 6.99 (2H, dd,= 8.9, 2.7 Hz, H-3, 5), 6.14 (2H, s, H-6, 8), 5.58 (1H, m, H-2), 4.98 (1H, t,= 8.1 Hz, H-1), 4.52 (1H, s, H-1), 3.77 (3H, s, 4-OCH3), 3.12 (1H, m, H-3a), 2.78 (1H, ddd,= 17.0, 10.2, 2.9 Hz, H-3b), 1.09 (3H, dd,= 6.3, 3.9 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 197.1 (C-4), 165.1 (C-7), 163.0 (C-5), 162.6 (C-9), 159.5 (C-4), 130.5 (C-1), 128.5 (C-6), 128.3 (C-2), 113.95 (C-5), 113.91 (C-3), 103.3 (C-10), 100.6 (C-1), 99.3 (C-1), 96.5 (C-6), 95.5 (C-8), 78.4 (C-2), 76.3 (C-5), 75.6 (C-3), 73.0 (C-2), 72.1 (C-4), 70.7 (C-4), 70.3 (C-3), 69.6 (C-2), 68.3 (C-5), 66.0 (C-6), 55.2 (4-OCH3), 42.3 (C-3), 17.85 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[26]，故鉴定化合物12为香蜂草苷。

3.2 抗神经炎症活性评价

化合物3、4、6、9、11、12在不影响BV-2细胞的细胞活力情况下，可以一定程度上抑制LPS诱导的BV-2细胞神经炎性因子NO的产生（图2），抑制率分别为23.01%、7.35%、12.12%、13.37%、14.60%和15.75%（表1），其中化合物3 [(2,3)- 肥牛木素]的活性最强，而化合物5、7～8、10在10 μmol/L的浓度下不能显著抑制LPS诱导的BV-2细胞神经炎性因子NO的产生。

MI-阳性对照米诺环素；与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

表1 化合物3～12对LPS诱导的BV-2细胞神经炎性因子NO的抑制率

4 讨论

本实验从缬草水提取物萃取得到的醋酸乙酯部位和水溶性部位中共分离得到12个化合物，主要包括木脂素7个、黄酮2个、二肽1个、蒽醌1个和萘酚糖苷1个，其中化合物1～4和6为5个首次从缬草属植物分离得到的化合物。神经炎症活性评价结果发现，其中化合物3～4、6、9、11～12均有不同程度抑制LPS诱导的BV-2细胞神经炎症的作用。本研究丰富了缬草属植物的化学成分，为该属植物的综合开发利用提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chemical constituents from water-soluble extract of

WU Xi-le1, LI Ran1, LI Shi-wei1, ZHANG Li-hua1, HAN Li-feng1, ZHANG Yi1, WANG Tao1, WANG Shao-xia2, WU Hong-hua1

1. State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. School of Integrative Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the chemical constituents of the water-soluble extract of.Silica gel and ODS column chromatography, preparative high-performance liquid chromatography were applied for isolation of constituents from the water-soluble extract. NMR, MS and other related spectroscopic analyses were used to identify their structures, and a Griess method was used to evaluate their inhibitory activity on lipopolysaccharide-induced inflammation of BV-2 cells.Twelve compounds were isolated and identified as tinnevellin-8--β--glucopyranoside (1), emodin-8-β--glucopyranoside (2), (2,3)-ceplignan (3), (−)-olivil-9--β--glucopyranoside (4), (−)-massoniresinol-3a--β--glucopyranoside (5), aurantiamide acetate (6), pinoresinol (7), 8-hydroxypinoresinol (8), pinoresinol-4--β--glucopyranoside (9), prinsepiol-4--β-- glucopyranoside (10), (2)-hesperidin (11) and didymin (12).Compounds 1―4 and 6 are firstly isolated from the genus. Compound 3―4、6、9、11―12 showed inhibition on the production of neuroinflammatory factor NO induced by LPS in BV-2 cells, without any detectable influence on the cell viabilities.

L.; naphthol glycoside; lignans; emodin-8-β--glucopyranoside; (2,3)-ceplignan; (−)-olivil-9--β--glucopyranoside; aurantiamide acetate

R284.1

A

0253 - 2670(2022)23 - 7331 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.003

2022-06-15

国家重点研发计划（2018YFC1707904）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2018ZX09735-002）；天津市中央引导地方科技发展专项（21ZYJDJC00080）

吴肸乐（1994—），女，硕士研究生，研究方向为中药化学药效物质基础。E-mail: 1154986475@qq.com

通信作者：吴红华（1983—），男，硕士生导师，副研究员。Tel: (022)59791833 E-mail: wuhonghua2011@tjutcm.edu.cn

[责任编辑 王文倩]