僵蚕提取液激活凝血因子XII介导缺血再灌注大鼠血管新生研究

王珊珊，徐 昊，梁 祺，杨 彤，李泽康，侯培媚，葛金文*

• 药理与临床•

僵蚕提取液激活凝血因子XII介导缺血再灌注大鼠血管新生研究

王珊珊1, 2，徐 昊1, 2，梁 祺1, 2，杨 彤1, 2，李泽康2, 3，侯培媚2, 4，葛金文1, 2*

1. 湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208 2. 湖南中医药大学，中西医结合防治心脑血管疾病湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208 3. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208 4. 湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南 长沙 410208

基于接触系统探讨僵蚕提取液激活凝血因子XII（coagulation factor XII，FXII）对缺血性脑卒中大鼠血管新生的干预作用。检测僵蚕提取液干预血浆凝血四项，体外检测僵蚕提取液对FXII及其下游底物激肽释放酶（kallikrein-kinin，KK）的激活作用。通过大鼠脑缺血再灌注损伤模型，检测大鼠的脑形态学及FXII、KK、血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factors，VEGF）、CD31、Brdu+/vWF+蛋白表达；通过氧糖剥夺模型，检测大鼠脑微血管内皮细胞的形态学改变、细胞增殖情况及VEGF的表达。采用LC-MS鉴定僵蚕提取液药效物质。在体外实验中，僵蚕提取液延长了人血浆部分凝血酶原时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）（＜0.05），激活FXII并导致下游底物KK的生成，呈剂量相关性（＜0.05）；在大鼠脑缺血再灌注模型中，僵蚕提取液改善了大鼠神经元损伤，激活了FXII，导致KK生成和VEGF、CD31、Brdu+/vWF+的表达增加（＜0.05、0.01）；在细胞氧糖剥夺实验中，僵蚕提取液干预提高了大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和VEGF的表达（＜0.05）。LC-MS鉴定僵蚕提取液含代谢物共计809个。僵蚕提取液可改善缺血再灌注大鼠神经功能损伤，其机制可能与抗凝和促脑微血管内皮细胞增殖有关。

缺血性脑卒中；僵蚕；凝血因子XII；缓激肽；血管内皮生长因子

缺血性脑卒中（ischemia stroke，IS）是临床高发病、高致残性疾病，是现今人类死亡率最高的3大疾病之一。1990—2017年所有死因排名中，卒中排名已上升至第1位[1]，其中，IS占比87%[2]，是血栓性疾病临床防治的难点、热点。目前研究认为IS是血栓形成和炎症联合递进反应的结果[3]。血栓的形成涉及血小板和凝血级联，其中凝血系统的激活促进了稳定血凝块的生成，是IS发病的关键发病机制，因此，目前针对IS的防治以抑制凝血因子（如凝血因子Хa、凝血酶）活性的抗凝或促纤溶为主。在凝血级联反应中，凝血因子XII（coagulation factor XII，FXII）的作用非常特殊，尽管许多研究认为FXII的激活与IS预后不良有关[4]，但IS死亡率和二次脑梗发生率与血浆FXII水平不呈正相关。而FXII激活还可引起接触、纤溶、补体等系统的激活，这些通路与促凝的内源性凝血途径并不同步发生，提示其多靶点作用可能从多途径调控了IS的病理转归。

接触系统是FXII通过与负电荷表面接触而发生构象改变，激活生成FXIIa，促进内源性凝血系统激活同时加速血浆激肽释放酶原（plasma kallikreinogen，PK）活化生成激肽释放酶（kallikrein-kinin，KK），导致高分子激肽原（high molecular weight kininogen，HK）裂解，促进血管活性物质缓激肽（bradykinin，BK）的产生[5-7]。在其他疾病病机研究中，BK有2个对应受体（BKR1、BKR2），BK与BKR2结合可促进肿瘤组织中血管内皮细胞生长因子的表达，从而有利于血管新生[8-9]。但是否在IS发病中存在类似的生理机制目前并不清楚。

僵蚕是蚕蛾科昆虫家蚕Linnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌(Bals.) Vuillant而致死的干燥体，具有抗凝血、抗血栓、促纤溶等功效，能够有效延长动物血浆部分凝血酶原时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT），主要抑制了FII及FⅩa的活性，提示了其对IS的干预效应[10-12]。IS的防治中溶栓、抗凝均有狭窄的时间窗伴出血并发症风险，导致临床使用受限。僵蚕经提取后虽具有抗凝效应，但其在体内实验中并未引起实验动物明显的出血并发症，其可能的机制目前尚未阐明，本实验拟针对僵蚕提取液干预FXII开展相关研究。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量（220±10）g，4周龄，购自斯莱克景达有限公司，合格证号SCXK（湘）2019-0004。动物于温度（26±2）℃环境下饲养，自由进食饮水。动物实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号LL2019092009）。

1.2 细胞

大鼠脑微血管内皮细胞、HEK-293细胞（批号CM-R108、CL-0001）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 药材

实验用僵蚕于2020年3月购自湖南中医药大学第一附属医院药房，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科邓桂明教授鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕4～5周龄幼虫感染白僵菌素致死的干燥体。

1.4 药品与试剂

APTT、PT、TT、FIB试剂盒（批号251730、114145、2551325、251560）购自法国Stago公司；FXII激活剂Bismuth subgallate（批号HY-B1560）购自美国MedChemExpress公司；BKR2抑制剂Icatibant acetate（批号S5695）购自美国Selleck生物科技有限公司；FXII抗体（批号DF6558）、KK抗体（批号DF7271）购自Affinity公司；VEGF抗体（批号Ab214424）购自英国Abcam公司；CD31抗体（批号GB11063-2）、β-actin（批号GB15003）、兔二抗（批号HG-SAR00002b）、鼠二抗（批号HG-SAM00001b）购自赛维尔生物科技有限公司；核转试剂盒（批号V4XC-2024）购自美国Lonza公司；CCK8试剂盒（批号BS350B）购自Biosharp公司。

1.5 仪器

Cytation 3多功能酶标仪（美国Biotake公司）；STA Compact Max全自动血凝仪（法国Stago公司）；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、GelDocXR＋凝胶成像系统、Mini Trans-Blot型转印槽、PowerPac™基础电泳仪电源（美国Bio-Rad公司）；4D-NucleofectorTMCore Unit核转仪（美国Lonza公司）。

2 方法

2.1 僵蚕提取液制备

称定白僵蚕100.0 g，煎煮沸腾30 min，煎煮2次，75%乙醇醇沉，4 ℃过夜；相对分子质量5000透析袋中透析，得到僵蚕提取液，高压灭菌后配制成105 mg/L，分装，封口，于4 ℃保存。水煎僵蚕浸出物得率为44.2%，醇沉后得率20.9%，最终僵蚕提取液得率为15.1%，符合《中国药典》僵蚕浸出物标准。

2.2 血浆制备

2.2.1 人血浆制备 健康人全血（纳入标准：20～65岁，无感冒、高血压、冠心病等急慢性疾病，无阿司匹林、华法林等抗凝药物服用史）来源于湖南中医药大学第一附属医院健康管理科。于湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治实验室离心制备成血浆，分装后于−80 ℃保存（6个月内）。

2.2.2 动物空白血清、血浆制备 4周龄雄性SD适应性喂养12 h后，ip 1 mL生理盐水，1次/d，连续7 d，于末次处理后6 h，ip 3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉，腹主动脉采血，部分全血装入5 mL空白管中，部分全血装入2 mL枸橼酸钠采血管中，编号，3500 r/min（血清4 ℃静置过夜）离心10 min得到大鼠空白血清、血浆，分装后于−80 ℃保存。

2.2.3 动物含药血浆制备 4周龄雄性SD大鼠适应性喂养12 h后，ip 1 mL僵蚕提取液（105 mg/L），1次/d，连续7 d，于末次给药后6 h，ip 25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，腹主动脉采血，全血装入2 mL枸橼酸钠采血管中，编号，3500 r/min离心10 min得到大鼠含药血浆，分装后于−80 ℃保存。

2.3 过表达FXII蛋白的HEK-293细胞制备

HEK-293细胞按核转试剂盒说明书操作转入FXII质粒，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，转染率可达95%，用G418筛选，获稳定表达FXII蛋白的HEK-293细胞。收集细胞上清液，10 μL/s上样蛋白纯化柱，0.25 nmol/L咪唑洗脱可得FXII纯化蛋白。

2.4 凝集实验

取健康人全血浆150 μL，分别加入150 μL 3、6、9 g/L僵蚕提取液或生理盐水，分别设为僵蚕提取液低、中、高剂量组和空白组，37 ℃孵育5 min，全自动血凝仪检测并记录PT、APTT、TT、FIB。

2.5 FXII激活实验

含FXII蛋白的细胞悬液，加入40 μL不同质量浓度（0.15、0.30、0.60、1.20 g/L）的僵蚕提取液，空白组加入生理盐水，激动剂组加入3.94×10−6g/L Bismuth subgallate，37 ℃孵育5 min，加入2×SDS上样缓冲液和2.5% β-ME，热水浴5 min后，上样10%丙烯酰胺胶，12 μL/孔，100 V跑胶，120 V湿转2 h后，于脱脂牛奶中封闭1 h，加入FXII抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，以ECL发光法于Bio-Rad ChemiDocTM成像系统显影。

2.6 KK生成实验

取人血浆20 μL，按“2.5”项下方法处理样本后（僵蚕提取液质量浓度为0.6、1.2 g/L），上样于8%丙烯酰胺胶，30 μL/孔，100 V跑胶，120 V湿转2 h后，于脱脂牛奶中封闭1 h，加入KK抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，以ECL发光法于Bio-Rad ChemiDocTM成像系统显影。

96孔板每孔加入20 μL人全血浆或缺FXII血浆，再分别加入40 μL僵蚕提取液（1 g/L），用40 μL生理盐水作为空白对照组、40 μL高岭土溶液作为阳性对照组。37 ℃孵育5 min，加入20 μL 5 mg/L S-2302，在酶标仪上37 ℃孵育30 min，每5分钟测定405 nm处的吸光度（）值。

2.7 动物模型制备

30只SD大鼠适应性喂养12 h后，随机分为空白组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、肝素组（150 IU）和僵蚕低、中、高剂量（0.45、0.9、1.8 mg/g，26.25、52.50、105.00 mg/L的僵蚕提取液）组。除空白组外，其余大鼠分离双侧颈总动脉，在小动物散斑成像仪下，用动脉夹夹闭1.5 min后放开1 min，连续操作5次后，成像仪中可见明显微血管血流减少（30±5）%，缝合皮肤。空白组仅分离双侧颈总动脉后缝合皮肤，手术后各组连续ip 1.2 mL相应药物3 d，处死取材。

2.8 大鼠脑组织指标检测

将各组大鼠脑组织采用4%多聚甲醛固定，经乙醇脱水、二甲苯透明等步骤包埋制成石蜡块，切片，进行苏木素-伊红（HE）染色观察脑组织病理变化；孵育KK、CD31、Brdu/vWF抗体，于显微镜下观察并拍照。取大鼠脑组织，于冰上匀浆，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，孵育FXII、KK、VEGF抗体及二抗，显影。

2.9 氧糖剥夺模型制备

将大鼠脑微血管内皮细胞分为空白组（10 μL 生理盐水）、空白血浆组（10%空白血浆）、僵蚕提取液联合血浆组（10% 26.25 mg/L僵蚕提取液＋10%空白血浆）、僵蚕提取液含药血浆组（10%僵蚕提取液含药血浆）、肝素组（10 IU肝素＋10%空白血浆）、激活剂组（10 nmol/L Bismuth subgallate＋10%空白血浆）、空白血清组（10%空白血清）、BKR2抑制剂组（15 nmol/L Icatibant acetate＋10%僵蚕提取液含药血浆），采用无糖培养基，5% CO2、1% O2条件下培养12 h，复氧30 min后，于显微镜下观察并拍照，采用CCK-8法检测细胞增殖，采用Western blotting法测定细胞内VEGF蛋白表达。

2.10 液相-色谱联用（LC-MS）鉴定僵蚕提取液代谢物

僵蚕提取液非靶代谢组学鉴定和分析由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，公司通过代谢物提取、LC-MS/MS检测以及数据分析等，得出实验数据，具体实验条件如下：Hyperil Gold C18色谱柱，正离子模式下，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～1.5 min，98% A；1.5～3 min，98%～15% A；3～10 min，15%～0 A；10～10.1 min，0～98% A；10.1～12 min，98% A。负离子模式下，流动相为pH 9的5 mmol/L醋酸铵水溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脱：0～1.5 min，2% B；1.5～3 min，2%～85% B；3～10 min，85%～100% B；10～10.1 min，100%～2% B；10.1～12 min，2% B。柱温40 ℃；体积流量0.2 mL/min。

2.11 统计学分析

3 结果

3.1 僵蚕提取液对健康成人凝血时间的影响

如图1所示，僵蚕提取液显著延长人PT、APTT、TT（＜0.05），呈剂量相关性；而FIB无统计学差异。

与空白组比较：*P＜0.05，图2、3同

3.2 僵蚕提取液对FXII的激活水平的影响

如图2所示，僵蚕提取液处理后，FXII原型蛋白表达显著降低（＜0.05）；随着僵蚕提取液质量浓度的增加，FXII原型蛋白表达逐渐降低，0.30 g/L僵蚕提取液与FXII纯化蛋白溶液1∶1混合孵育，即可使FXII蛋白表达明显降低（＜0.05），1.20 g/L僵蚕提取液干预下，FXII蛋白表达减少趋近于FXII激活剂的作用效果。

3.3 僵蚕提取液对血浆中KK表达的影响

如图3-A所示，僵蚕提取液干预后，血浆KK表达量明显增加，呈剂量相关性（＜0.05）；如图3-B所示，在动力学实验中，僵蚕提取液导致血浆中KK表达量增加较空白组更为明显，在5 min时缓慢起效，随着时间的增加，其表达快速增加，至25 min时，增加趋势开始减缓，在FXII缺乏的血浆中，这种增加的趋势消失（＜0.05）。

图2 僵蚕提取液对FXII蛋白表达的影响(, n = 3)

图3 Western blotting (A) 和酶标仪(B) 检测僵蚕提取液对血浆中KK表达的影响(, n = 3)

3.4 缺血再灌注损伤大鼠模型的验证

如图4所示，双侧颈总动脉反复结扎损伤后，大鼠脑血流量明显减少，以右侧脑减少更为明显，部分小血管血流消失，血管分支变细或消失，平均血流减少30%。

3.5 僵蚕提取液对缺血再灌注损伤大鼠脑形态学改变的影响

如图5所示，与空白组比较，模型组脑组织镜下可见大量的细胞凋亡，部分细胞核固缩，胞质成空泡状。僵蚕提取液干预后，核固缩细胞明显减少，细胞纹理清晰，空泡减少，呈剂量相关性。

图4 缺血再灌注大鼠脑血流图

图5 僵蚕提取液对缺血再灌注损伤大鼠脑形态学影响(HE, ×200)

3.6 僵蚕提取液对缺血再灌注大鼠脑组织脑激肽释放系统和血管新生的影响

如图6所示，与空白组比较，模型组和肝素组FXII蛋白激活不明显，KK和VEGF蛋白表达显著升高（＜0.05）。与模型组比较，僵蚕提取液组FXII原型蛋白表达明显降低（＜0.05），呈剂量相关性，提示蛋白大量激活；KK和VEGF蛋白表达进一步升高（＜0.05），呈剂量相关性。

如图7所示，在KK的免疫荧光实验中也得到Western blotting类似的结果，与空白组比较，KK表达在各组中均增加（＜0.05），但僵蚕提取液组更佳，且剂量相关性。在免疫荧光实验中，与空白组比较，模型组、肝素组CD31和Brdu+/vWF+未见明显增加；与模型组比较，僵蚕提取液组CD31和Brdu+/vWF+有明显表达（＜0.05、0.01），且剂量相关性。

与空白组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，图7同

图7 僵蚕提取液对缺血再灌注损伤大鼠脑血管生成相关蛋白表达的影响(, n = 3)

3.7 僵蚕提取液对氧糖剥夺模型大鼠脑微血管内皮细胞形态学变化的影响

如图8所示，在同时造模后，各组细胞均有所改变，出现细胞固缩、透光性降低改变，空白血浆组和FXII激活剂组有明显的纤维蛋白生成，镜下可见明显的纤维蛋白团块和纤维蛋白丝。空白组、肝素组、空白血清组和BKR2抑制剂组虽未见明显的纤维蛋白凝块，但贴壁细胞数量明显减少，固缩明显，透光性差，细胞增殖不良。僵蚕提取液和大鼠血浆共同干预下，未见明显纤维蛋白团块，其细胞数量也明显高于血浆组，但细胞可见部分死亡和固缩现象。僵蚕提取液含药血浆组细胞状态明显优于其他处理组，细胞透光性强，未见明显细胞死亡和形态改变。

图8 僵蚕提取液对氧糖剥夺模型大鼠脑微血管内皮细胞形态的影响(×100)

3.8 僵蚕提取液对氧糖剥夺模型大鼠脑微血管内皮细胞增殖的影响

如图9所示，与空白血浆组比较，肝素组、僵蚕提取液联合血浆组和僵蚕提取液含药血浆组内皮细胞增殖明显，其中僵蚕提取液含药血浆组效果最为明显（＜0.01）。但与空白组和空白血浆组比较，仅僵蚕提取液联合血浆组和僵蚕提取液含药血浆组VEGF蛋白表达明显增加（＜0.05）。

3.9 LC-MS鉴定僵蚕提取液非靶代谢物

LC-MS共鉴定僵蚕提取液非靶代谢物809个，其中，正离子模式鉴定代谢物479个，负离子模式鉴定代谢物330个，共计有21个含量较高的代谢物（峰面积/总面积≥1.0%，见图10和表1）。

与空白组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与空白血浆组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01

图10 正 (A)、负 (B) 离子模式下的僵蚕提取液TIC图

表1 僵蚕提取液21个高含量代谢物

4 讨论

IS是一种高发病率、高致死率的疾病，随着发病率的逐年增加，呈年轻化趋势，其病机和开发新的防治药物仍为研究的热点。目前认为IS病程转归不但与血栓形成有关，炎症导致的无复流现象也影响疾病的预后。FXII是内源性凝血途径的启动因子[13]，研究认为FXII促进血栓的形成，引起局部组织水肿，不利于IS的恢复，但FXII激活对下游底物的作用效果并不同步。研究表明FXII活化后最先激活PK，导致BK生成。在肿瘤研究中发现BK可通过与细胞表面BKR2结合，促进VEGF生成，参与血管新生，提示了FXII在IS发病中可能还发挥着有利的生理功能。

《本草纲目》记载僵蚕具有“治风化痰，散结行经”之功，常被用于治疗IS的配伍方剂中，以助活血化瘀之效。本课题组前期研究证实僵蚕经提取后具有延长兔凝血时间的作用，与肝素类似[12]。本研究中将僵蚕按原法再次提取，在人血浆体外实验中得到了相同结果，再次证实了僵蚕提取液良好的抗凝活性。然而，这种提取工艺下的僵蚕提取液在与FXII共孵育后，降低了FXII原型蛋白含量，提示其导致蛋白水解。为证实FXII的激活，检测了一系列下游蛋白的活化情况。结果显示，僵蚕提取液干预后血浆中KK含量明显增多，这一效果在缺乏FXII血浆中消失。但其作用弱于FXII激活剂高岭土和Bismuth subgallate，这可能与僵蚕提取液水解FXII的位点有关。提示僵蚕提取液对FXII的激活作用主要导致了接触系统的活化。

为阐明僵蚕提取液在其中的作用，本课题组运用大鼠缺血再灌注模型观察僵蚕的药效机制。在均一造模条件下，随着僵蚕提取液干预浓度的增加，大鼠脑神经元损伤程度减轻，脑组织中FXII原型蛋白减少，但外周血FXII的含量无明显改变，且抗凝效果明显弱于体外实验，提示僵蚕提取液中活性成分并非直接激活血液中的XII发挥IS干预效应。同时，造模后脑内KK和VEGF的生成也有增加，但并无血管新生，只有僵蚕提取液干预下可见明显新生血管。新生的血管可提高缺血区血供，有利于缓解脑缺血后的组织损伤，僵蚕提取液可能从这一途径改善了大鼠脑缺血再灌注的转归。为证实这一假说，通过细胞实验开展进一步研究。本研究用僵蚕提取液直接干预大鼠脑微血管内皮细胞发现其并无增殖效应，提示僵蚕提取液并不能直接作用导致细胞增殖。基于此，本研究以血浆作为基质，以期提供FXII、PK、HK等接触系统相关蛋白。氧糖剥夺实验显示空白血浆干预组由于血浆中凝血因子被激活，细胞培养基内有明显纤维蛋白团块生成，而僵蚕提取液联合血浆组和僵蚕提取液含药血浆组纤维蛋白团块明显减少或消失，提示僵蚕提取液具有明显抗凝作用，但含药血浆的抗凝效应明显弱于联合干预组，提示僵蚕提取液在体内可能经过相关代谢减弱了其抗凝效应。然而，血清组和肝素组由于凝血因子缺乏或抑制，也表现出明显抗凝作用，但细胞凋亡明显，提示其药效不仅来源于抗凝效应。进一步实验显示，僵蚕提取液干预下脑微血管内皮细胞内VEGF的表达明显增高，内皮细胞增殖明显，其中，僵蚕提取液含药血浆组效应优于僵蚕提取液联合血浆组，提示经过体内代谢，僵蚕提取液的促血管增殖效应增强，但使用BKR2阻断剂后，细胞增殖作用消失，提示BKR2是僵蚕发挥血管新生的关键靶点。

本研究以FXII介导接触系统激活为基础进一步证实了其在IS发病过程中血管新生的可能机制，而僵蚕提取液通过促进FXII的激活加速了该过程的发生。基于此，本研究通过LC-MS对僵蚕提取液的代谢产物进行了鉴定，809个已鉴定代谢物中有大量有机酸类化合物、氨基酸及脂肪族化合物等，与僵蚕虫类药属性相符。后续拟进一步鉴定比对入血和入脑化合物，以期阐明僵蚕提取液的药效物质基础。FXII参与了IS接触激活和血管生成，而僵蚕提取液改善了缺血再灌注大鼠神经功能损伤，可能与抗凝联合激活FXII导致缓激肽生成，介导VEGF生成和血管内皮细胞增殖有关。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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extracts activates coagulation factor Ⅻ to promote angiogenesis in rats with ischemia/reperfusion

WANG Shan-shan1, 2, XU Hao1, 2, LIANG Qi1, 2, YANG Tong1, 2, LI Ze-kang2, 3, HOU Pei-mei2, 4, GE Jin-wen1, 2

1. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 4. College of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To explore the interventional effect of Jiangcan () extracts as an activator of coagulation factor Ⅻ (FⅫ) on angiogenesis of rats with ischemic stroke by contact system.The effects ofextract on plasma coagulation were detected, and the activation of FXII and its downstream substrate kallikrein kinase (KK) byextract was detected. The brain morphology and expressions of FXII, KK, vascular endothelial growth factors (VEGF), CD31, Brdu+/vWF+were detected by rats model of cerebral ischemia reperfusion injury; The morphological changes, cell proliferation and VEGF expression of brain microvascular endothelial cells were detected by oxygen glucose deprivation model. The pharmacodynamic substances ofextract were identified by LC-MS.,extract prolonged the activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT), thrombin time (TT) (< 0.05), activated FⅫ and promoted the production of downstream substrate KK, with dose-dependent (< 0.05). In the model of cerebral ischemia reperfusion in rats,extract improved the neuronal damage of rats, activated FXII and increased the production of KK and the expressions of VEGF, CD31, Brdu+/vWF+(< 0.05, 0.01); In the cell oxygen and glucose deprivation experiment,extract increased the proliferation of brain microvascular endothelial cells and expression of VEGF in rats (< 0.05).A total of 809 metabolites inextract were identified by LC-MS.extract can ameliorate the injury of nerve function in rats with ischemia-reperfusion, and its mechanism may be related to anticoagulation and promoting the proliferation of brain microvascular endothelial cells.

ischemic stroke;; coagulation factor Ⅻ; bradykinin; vascular endothelial growth factor

R285.5

A

0253 - 2670(2022)23 - 7421 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.012

2022-08-19

湖南省自然科学基金资助项目（2020JJ5424）；湖南省教育厅青年基金资助项目（21B30386）；湖南中医药大学中西医结合“双一流”学科开放基金资助项目（2020ZXYJH08）

王珊珊（1990—），女，在读博士，讲师，研究方向为中西医结合防治脑血管病、中药药理。E-mail: 68761083@qq.com

通信作者：葛金文（1965—），男，博士，教授，研究方向为中西医结合防治脑血管病、中药药理。E-mail: 001267@hnucm.edu.cn

[责任编辑 李亚楠]