基于超高效液相色谱法-串联质谱技术和网络药理学的复方感冒灵成分及作用机制验证

刘黎明 戴玉豪 杨 维 符国成 龚小兵 刘 陈 吴文洁 陈海刚 李韶菁

(1 中国中医科学院中药研究所，北京，100010； 2 华润三九(郴州)制药有限公司，郴州，423000； 3 安徽中医药大学，合肥，230000)

复方感冒灵颗粒是由山银花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板蓝根、岗梅、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因组成的复方制剂，具有辛凉解表、清热解毒的功效，主治风热感冒之发热，微恶风寒，头身痛，口干而渴，鼻塞涕浊，咽喉红肿疼痛，咳嗽，痰黄黏稠等症。本研究采用超高效液相色谱法-串联质谱(Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)技术对复方感冒灵颗粒醇提物中主要化学成分进行鉴定并确定其来源归属。

基于复方感冒灵成分谱的确定，本部分将复方感冒灵给予大鼠后，选取不同给药后的时间点进行取样，采用UPLC-MS/MS技术鉴定大鼠血清中复方感冒灵颗粒的主要化学成分，进行复方感冒灵入血成分谱的鉴定。

目前复方感冒灵颗粒成分、靶点、功效、疾病之间的相互联系未见报道。因此，本研究在复方感冒灵主要药效成分的基础上，首次对其进行整合网络药理学的研究，建立成分、靶点、功效、疾病的关系网络，为该药作用机制阐明奠定了基础。再利用网络药理学方法对复方感冒灵给予大鼠后体内高暴露的成分进行分析，针对其主要药理作用预测作用靶点和通路，构建“成分-靶点-功效-疾病”关系网络，探讨其主要作用通路及靶点，并进行靶点验证分析，为该药的作用机制研究提供依据[1-3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 RAW264.7细胞购自国家生物医学实验细胞资源库(BMCR)，货号：SCSP-5036。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，7周龄，体质量210～230 g。由北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]提供，置于温度(25±2)℃，湿度40%～70%饲养室，动物均自由饮水进食，12 h/12 h明暗交替。实验动物的使用在中国中医科学院中药研究所动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK(京)2015-0041]进行。实验方案实施前获得中国中医科学院中药研究所实验动物管理和使用委员会的审核与批准(伦理审批号：2021B193)。

1.1.2 药物 绿原酸(批号：DSTDL002101)、新绿原酸(批号：DSTDX001502)、隐绿原酸(批号：DSTDY003502)、异绿原酸A(批号：DSTDY003601)、异绿原酸B(批号：DSTDY003701)、异绿原酸C(批号：DSTDY003801)、齐墩果酸(批号：DSTDQ005101)、腺苷(批号：DSTDX004701)和毛冬青酸(批号：DST201201-037)购自成都德思特生物技术有限公司。蒙花苷(批号：H-123100-NU1)、断氧化马钱子苷(批号：H-168300-NU1)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(批号：H-156300-NU1)购自深圳振强生物技术有限公司。马来酸氯苯那敏(批号：C015-190414)、咖啡因(批号：1012004405)、对乙酰氨基酚(批号：202007119A)、山银花(批号：20201001，产地湖南)、野菊花(批号：20201001，产地安徽)、岗梅(批号：20201002，产地广东)、三叉苦(批号：20201002，产地广西)、五指柑(批号：20201002，产地广西)、南板蓝根(批号：20201002，产地广西)、复方感冒灵颗粒流膏(批号：Z2012122)和复方感冒灵颗粒成品(批号：2012020)均由华润三九(郴州)制药有限公司提供。

1.1.3 试剂与仪器 甲醇(MeOH，HPLC纯试剂，Honeywell公司，德国，货号：AH230-4)；甲酸(ROE公司，美国，货号：Y0001970)；胎牛血清(Hyclone公司，美国，货号：SH3040602)；DMEM培养基(Invitrogen公司，美国，货号：C11995)；0.25%胰蛋白酶(Invitrogen公司，美国，货号：25200056)；青-链霉素双抗溶液(Invitrogen公司，美国，货号：15140122)；PBS缓冲液(碧云天生物技术公司，货号：C0221A)；肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)试剂盒(碧云天生物技术公司，货号：PT516)；白细胞介素(Interleukin，IL)-2 ELISA试剂盒(碧云天生物技术公司，货号：PI577)；IL-17 ELISA试剂盒(碧云天生物技术公司，货号：PI548)。UltiMate 3000液相色谱仪(Dionex公司，美国，型号：Dionex UltiMate 3000)；Q-ExactiveTM Orbitrap质谱仪(Thermo公司，美国，型号：IQLAAEGAAPFALGMAZR)；Techne氮气吹干装置(Techne公司，美国，型号：NAI-DCY-24Y)；IKA Vibrax VXR小型摇床(IKA Vibrax VX公司，德国，型号：IKA Vibrax VXR)；IKA MS3 Basic涡旋混合器(IKA MS3 Basic公司，德国，型号：IKA MS3 Basic)；CO2恒温培养箱(Genscript公司，中国，MCO-15AC)；台式高速冷冻离心机(长沙湘仪仪器有限公司，型号：H-1850R)；酶标仪(Tecan公司，瑞士，型号：SUNRISE)；万级天平(上海精密科学仪器有限公司，型号：FA2204B)；数显恒温搅拌恒温水箱(常州国华电器有限公司，型号：HH-60)。

1.1.4 网络药理数据库 绘制化合物结构：Chemdraw软件。化合物作用靶点预测：Pubchem数据库，Swiss Target Prediction数据库。作用靶点信息规范：Uniprot数据库。药效作用相关靶点收集：在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，GeneCards数据库。构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络：STRING数据库。PPI网络可视化：Cytoscape软件。生物学功能分析：Metascape数据库。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制 对照品溶液：精密吸取1 mg/mL对照品溶液各30 μL，加入甲醇550 μL，涡旋混匀，配制成浓度为30 μg/mL的混合对照品溶液。精密吸取30 μL 30 μg/mL的混合对照品溶液，加甲醇870 μL，涡旋混匀，配置成浓度为1 μg/mL的混合对照品溶液。供试品溶液：1)药材处理。精密称取中药粉末1 g，加入75%甲醇10 mL，浸泡1 h，超声提取30 min，12 000×g离心10 min，过滤膜，滤液4 ℃保存。2)浸膏处理。称量浸膏0.1 g，加入75%甲醇10 mL，超声溶解，12 000×g离心10 min，取1 mL过滤膜，滤液4 ℃保存。3)复方感冒灵颗粒处理。复方感冒灵颗粒研磨粉碎，称取1 g，加入75%甲醇10 mL，超声溶解，12 000×g离心10 min，取1 mL过滤膜，滤液4 ℃保存。4)血浆样品处理。混合同一时间点血浆样品，加入3倍量甲醇溶液，1 500×g涡旋5 min，12 000×g离心10 min，吸取上清液，氮气吹干，90%水甲醇复溶，1 500×g涡旋5 min，12 000×g离心10 min，吸取上清液进样分析。

1.2.2 色谱及质谱条件 1)色谱条件。色谱柱：Acquity UPLC ® HSS C18 column(1.8 μm，2.1 mm×150 mm，ID：186003976)。柱温：40 ℃。流动相：A，H2O(0.1% HCOOH)；B，CH3OH。洗脱条件见表1。流速：0.3 mL/min。样品温度：6 ℃。分析时间：42 min。2)质谱条件。电喷雾离子源正/负离子检测模式，电离源电压3 800 V，毛细管电压，雾化温度320 ℃；离子传输管温度350 ℃，S-Lens射频电压60 V，鞘气流速40 arb，辅助气流速10 au，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，采用高分辨全离子扫描-数据依赖-二级离子扫描模式(Full MS ddMS2)；一级全离子扫描(分辨率R=70 000，扫描质量范围m/z 75～1 125)，二级全离子扫描(分辨率R=17 500)，碰撞电压(NES)为20 eV、40 eV和60 eV。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

1.2.3 检测 SD大鼠(n=6)适应喂养后，口服给予临床剂量复方感冒灵颗粒提取物。眼静脉丛采血。采血时间点：给药前0 min，给药开始后5 min、15 min、30 min以及1 h、2 h、4 h、6 h、8 h及24 h后。采集血样于乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA)抗凝EP管中，12 000×g离心1 min，转移上层血浆至EP管中，于-70 ℃保存。采用液质联用技术进行全谱分析，基于复方感冒灵颗粒成分谱，结合化合物精确质量数、碎片谱和裂解规律对复方感冒灵颗粒在体内主要的暴露成分、乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏的代谢产物进行分析。

1.2.4 单体化合物靶点的获取 利用Chemdraw软件绘制化合物结构，通过Pubchem数据库比对后上传至Swiss Target Prediction数据库并限定物种为“Homo sapiens”，对体内暴露的17种单体化合物的作用靶点进行预测，筛选条件为probability值>0，删除重复靶点，使用Uniprot数据库对靶点进行规范[4]。

1.2.5 药效作用靶点的获取 以“Antibacterial”“Anti-inflammatory”“Antipyretic”“Antiviral”等作为关键词，使用OMIM、GeneCards数据库收集汇总与复方感冒灵抗菌、抗炎、解热、抗病毒4种主要药效作用的相关靶点，并运用Uniprot数据库进行转换[5-7]；删除重复靶点基因，构建药效作用靶点数据库。

1.2.6 入血成分发挥药效靶点预测及PPI网络构建与拓扑属性分析 通过韦恩图取交集，获得药效与成分的共靶点。将共靶点上传STRING数据库，限定物种“Homo sapiens”，构建成分-药效作用靶标的PPI网络[8]。采用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析，分析相关靶点的拓扑参数，筛选大于交集网络所有节点中位值的靶点，得出排名前10位的关键靶点[9]。

1.2.7 基因本体富集分析和京都基因与基因组百科全书富集分析 将交集基因导入Metascape数据库[10]，物种限定“Home Sapiens”，利用Enrichment功能，依次选择生物过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)对药效的靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，获得三九感冒灵“成分-靶点-通路-功效”网络图。按P value升序进行排序，筛选出具有显著差异的生物过程和可靠的靶点通路，进行可视化分析，将结果以三合一条形图与双Y轴两侧条形图展示。

1.2.8 靶点验证分析 取生长状态良好的RAW264.7细胞，以每孔5×105个的密度接种在24孔细胞培养板，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养过夜后，磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)清洗2遍。将细胞分为空白对照组、模型组、给药组。空白对照组和模型组加入500 μL杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)，给药组加入含高剂量、中剂量、低剂量感冒灵颗粒药液的DMEM各500 μL预处理1 h后，模型组和给药组均加入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激细胞，终浓度为1 μg/mL，18 h后收集细胞培养基，4 ℃、1 000×g离心10 min后取上清液。采用ELISA法分别检测TNF-α、IL-2、IL-17的表达水平。

2 结果

2.1 样品检测结果 根据化学成分的精确质量数、碎片谱和裂解规律开展复方感冒灵颗粒及其组成中药的成分谱分析，并确定复方感冒灵颗粒的化学组成以及成分来源归属。见表2。本研究在复方感冒灵颗粒中共鉴定出170个化合物，包括167个中药类成分(黄酮类38个、有机酸类15个、生物碱类8个、香豆素类10个、环烯醚萜苷类7个、萜类35个、苯并吡喃类和色烯类化合物10个、酚酸类27个、喹唑酮类5个、吲哚类2个、其他类9个)、3个化药类成分和1个辅料成分。各成分在复方感冒灵颗粒提取液中的色谱峰面积在1×109以上的成分共7个，按峰面积从大到小的顺序排列依次为咖啡因、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、异绿原酸C、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸B。见图1。

图1 单体化合物药效靶点交集

2.2 入血成分检测结果 对复方感冒灵颗粒入血成分进行鉴定，共得到21个体内暴露成分，包括17个中药成分、3个化药成分和1个辅料。见表2。

表2 复方感冒灵颗粒体内暴露成分详细信息

2.3 复方感冒灵颗粒体内暴露成分的靶点筛选 对体内暴露的17种单体化合物的作用靶点进行预测，共检索得到211个作用靶点。对抗菌、抗炎、解热、抗病毒4种主要药效的相关靶点进行检索，得到583个潜在靶点，并与化合物的作用靶点取交集得到43个共靶点。

2.4 PPI网络建立及核心靶点筛选 构建单体化合物与药效作用43个交集靶点的PPI分析网络，节点表示预测靶点，节点之间的连线代表2个靶点间具有相互作用关系。见图2。筛选出前10个核心靶点，包括肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA)、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)、胱天蛋白酶3(Caspase-3，CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2，PTGS2)、促分裂原活化的蛋白激酶1(Mitogen-activated Protein Kinase-1，MAPK1)、信号转导及转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3，STAT3)、基质金属蛋白酶9(Mitochondrial Membrane Potential-9，MMP9)、白细胞介素-2(IL-2)以及促分裂原活化的蛋白激酶14(Mitogen-activated Protein Kinase-14，MAPK14)。见表3。

图2 单体化合物与药效交集靶点PPI

表3 预测复方感冒灵颗粒发挥药效的核心靶点

2.5 成分-靶点-通路-功效网络的构建与分析 核心靶点对应信号通路分析，获得三九感冒灵“成分-靶点-通路-功效”网络图，黄色节点(AI、AV、AP)代表药效；紫色节点(KJ、SP、YBA、MHG、BP、BT、DY)代表复方感冒灵颗粒的入血成分；蓝色节点代表入血成分的作用靶点；绿色节点代表作用靶点富集的信号通路；节点间的连线表示成分、靶点、药效、通路的连接关系。见图3。选择复方感冒灵颗粒7个入血成分的21个作用靶点分析，主要与抗炎(Anti-inflammatory，AI)、抗病毒(Antiviral，AV)、解热(Antipyretic，AP)3种药效产生关联，富集在55个信号通路上。

图3 复方感冒灵颗粒“成分-靶点-药效-通路”网络

2.6 靶点GO功能分析及KEGG通路分析 PPI网络重要靶点的富集分析显示，复方感冒灵颗粒作用涉及细胞迁移调控、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路调控、炎症反应调控等生物过程，GO分析了重要靶点在BP、CC以及MF 3个大类中的富集，根据富集程度列举排名前7的生物学功能条目。见图4。其中绿色代表BP，橘色代表CC，蓝色代表MF；富集程度排名前7的生物学功能条目主要包括miRNA对参与基因沉默的miRNA产生的调控，RNA对参与基因沉默的小RNA产生的调控，细胞对镉离子的反应，神经炎症反应的调节，对尼古丁的反应，神经炎症反应，miRNA沉默基因中miRNA的产生，按照差异显著性进行排列。见表4。KEGG分析了重要靶点的生物信号通路富集，根据富集程度列举排名前15的生物信号通路，结果显示，靶点主要涉及糖尿病并发症通路、癌症蛋白多糖通路、癌症通路、IL-17信号通路、丙型肝炎、TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、麻疹、血小板激活等信号通路，根据差异显著性值对富集程度前15的生物信号通路进行排列。见图5，表5。

图4 靶点GO功能富集分析

图5 靶点KEGG通路分析

2.7 靶点验证分析 感冒灵颗粒对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型TNF-α、IL-2、IL-17释放的影响，与空白对照组比较，模型组RAW264.7细胞TNF-α、IL-2、IL-17水平升高(均P<0.01)；与模型组比较，感冒灵颗粒各剂量组均抑制TNF-α、IL-2、IL-17水平(均P<0.01)。见图6。

图6 复方感冒灵颗粒对RAW264.7细胞TNF-α、IL-2、IL-17水平影响

3 讨论

复方感冒灵颗粒具有辛凉解表、清热解毒的功效，主治风热感冒之发热，微恶风寒，头身痛，口干而渴，鼻塞涕浊等症。但其物质基础仍然不清楚，因此本研究以UPLC-MS/MS为研究方法，探讨复方感冒灵颗粒的药效物质基础。共鉴定出复方感冒灵颗粒的170个化合物，包括中药类成分、化药类成分和辅料成分，成功构建了复方感冒灵颗粒成分谱，确定各成分来的中药来源，其为复方感冒灵的深入研究提供理论依据。

采用液质联用技术对复方感冒灵颗粒给予大鼠后，大鼠体内血清的暴露成分进行系统研究，确定了复方感冒灵的入血成分群，为后续网络药理学预测其发挥抗炎、抗病毒、抗菌等药理作用的研究提供物质基础。

基于网络药理学，对体内暴露的中药成分分析，构建了复方感冒灵颗粒“成分-靶点-通路-功效”的关联网络。17个中药成分作用于211个靶点，与功效的交集靶点共43个，依据PPI分析得到的前10位核心靶点为TNF、VEGFA、EGFR、CASP3、PTGS2、MAPK1、STAT3、MMP9、IL-2以及MAPK14[11-17]，主要涉及对细胞迁移调控、对跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路调控、对炎症反应调控等生物过程。如具有双向免疫调节作用的免疫激活剂(IL-2)；激活多条信号转导通路，参与细胞凋亡、炎症和免疫的TNF(肿瘤坏死因子)[18]；与非小细胞肺癌相关的EGFR(表皮生长因子受体)、MMP-9(基质金属蛋白酶9)，MMP-9作为特异性降解细胞外基质的蛋白酶家族成员，在气道重塑中也起非常重要的作用[19-20]；参与细胞凋亡、癌基因转化、炎症反应的MAPK家族等。KEGG通路富集分析显示，复方感冒灵颗粒的成分涉及糖尿病、IL-17信号通路、麻疹、血小板激活等多种信号通路。复方感冒灵核心靶点对应的功效为解热、抗炎与抗病毒，发挥该药理作用的化合物可能为：三甲氧基苯甲醇-葡萄糖苷、蒙花苷、白当归素-O-葡萄糖苷、丙基葡萄糖-脱水葡萄糖、断氧化马钱子苷、异绿原酸B、异绿原酸A与块茎酸葡萄糖苷。在细胞水平上，采用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型实验。结果显示相较于模型组，复方感冒灵颗粒各给药组的TNF、IL-2、IL-17水平均下降且有统计学差异，提示复方感冒灵的部分核心靶点TNF、IL-2、IL-17，可能是发挥抗炎作用的信号通路。

综上所述，复方感冒灵颗粒展现出其广泛的临床方面的应用潜力。本研究采用UPLC-MS/MS技术与整合网络药理学相结合的方法，对复方感冒灵颗粒的成分谱、体内代谢谱、作用靶点及其信号通路进行了系统研究，初步揭示了复方感冒灵解热、抗炎与抗病毒功效的物质基础，揭示了其作用机制可能与TNF、VEGFA、EGFR、CASP3、PTGS2、MAPK1、STAT3、MMP9、IL-2以及MAPK14信号通路相关，阐明了其多成分、多靶点的治疗特点，为复方感冒灵的深入研究提供理论依据。