氯雷他定与消风止痒颗粒对3种荨麻疹动物模型的药效评价研究

庞 博 徐英莉 刘晓峰 陈梦苹 王雅欣 姚荣妹 周利润 曹 姗 崔晓兰

(1 中国中医科学院中药研究所生物安全实验室，北京，100700； 2 辽宁医药职业学院，沈阳，110101； 3 天津中医药大学中医药学院，天津，301617)

慢性荨麻疹(Chronic Urticaria,CU)是由于皮肤黏膜小血管暂时扩张和通透性增加而引发的一种局限性血管反应，临床表现为风团，常伴有剧烈瘙痒。发病原因有外源性、内源性及特发性3种因素,外源性因素主要有食物、药物、感染、吸入物及物理刺激；内源性主要有精神因素、全身性疾病及免疫异常；特发性多被认为是多因素诱发。现代对慢性荨麻疹的研究认为是体内可能存在组胺释放因子或肥大细胞呈高反应性现象，在多因素刺激下使肥大细胞活化、脱颗粒、释放组胺等介质，导致荨麻疹[1]。荨麻疹发病中主要效应细胞为肥大细胞，其发病的中心环节为肥大细胞活化以及活化后发生的事件。引起肥大细胞活化的机制有免疫机制及非免疫机制，免疫机制中Ⅰ型变态反应作用机制最为明确，在急性荨麻疹发病中起重要作用，但与慢性荨麻疹发生的关系不大。体内的抗IgE分子及抗IgE受体的自身抗体可以通过Ⅱ型变态反应活化肥大细胞，这一机制在慢性自发性荨麻疹发生中占重要地位。非免疫机制在荨麻疹尤其是慢性荨麻疹发生中起重要作用，物理因素、微生物感染可不经过免疫途径激活肥大细胞。

本研究选用临床常用治疗荨麻疹的西药代表药氯雷他定和中药代表药消风止痒颗粒为研究对象，对3种荨麻疹动物模型进行给药治疗，探究2种临床常用药对不同因素引发的慢性荨麻疹在药效学是否存在不同，为氯雷他定和消风止痒颗粒临床合理用药提供药效学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级6周龄BALB/c小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半；SPF级7周龄SD大鼠，体质量(200±20)g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。普通级7周龄豚鼠，体质量(260±10)g，雌雄各半，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2020-0002。所有动物均饲养在(23±1)℃，湿度(50±2)%的实验室环境，自由饮食饮水。实验中所有操作均遵循美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)及北京市实验动物伦理委员会的规定，并经过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准(伦理审批号：小鼠为2021D021；大鼠为2021D025；豚鼠为2021D026)。

1.1.2 药物 氯雷他定片(拜尔医药保健有限公司启东分公司，生产批号：JS13160)；消风止痒颗粒(陕西华西制药股份有限公司，生产批号：210731)。

1.1.3 试剂与仪器 二硝基苯基(Dinitrophenyl，DNP)-IgE单克隆抗体(SIGMA公司，美国，批号：22181012)；2,4-二硝基氟苯(2，4-Dinitrofluorobenzene，DNFB)(SIGMA公司，美国，批号：BCCD3869)；伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司，批号：20200730)；卵白蛋白(SIGMA公司，美国，批号：SLCH2414)；氢氧化铝(国药集团化学试剂有限公司，批号：20201119)；甲苯胺蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司，批号：20210427)；台氏液(北京索莱宝科技有限公司，批号：20210426)；二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)(北京拜尔迪生物科技有限公司，批号：12029032)；无水乙醇(天津大茂化学试剂厂，批号：20210415)；小鼠血清IgE试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，批号：L210304289)；小鼠血清组胺试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：05/2021)；小鼠血清5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：05/2021)；大鼠血清IgE试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，批号：L210513363)；大鼠血清P物质试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，批号：L210513361)。电子分析天平(OhausCorp.Brock.WJ.，美国，型号：AR1140)，电子天平(上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002)，电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：AL204]，低温高速离心机(Eppendorf，德国，型号：5810R)，多功能酶标仪(PerkinElmer公司，美国，型号：En-spire)，倒置显微镜(OPYMPUS公司，日本，型号：CKX41)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 小鼠免疫性接触性慢性荨麻疹模型 BALB/c小鼠40只，按体质量随机分为正常对照组、模型对照组、氯雷他定组、消风止痒颗粒组，每组10只，雌雄各半。每组小鼠预先背部去毛2 cm×2 cm，除正常对照组外，其余各组小鼠尾静脉注射1∶5 000抗DNP-IgE单克隆抗体进行致敏造模，0.5 mL/只。24 h后，各致敏造模组小鼠双耳背面涂0.15% DNFB 50 μL进行激发，正常对照组在同等条件下注射及涂抹生理盐水[2-3]。

1.2.1.2 大鼠免疫性非接触性慢性荨麻疹模型 40只SD大鼠，按体质量随机分为正常对照组、模型对照组、氯雷他定对照组、消风止痒颗粒组，每组10只，雌雄各半。致敏造模：实验第1天除正常对照组外，其余各组大鼠腹腔注射1 mg卵白蛋白致敏，注射体积为1 mL，氢氧化铝作为佐剂(卵白蛋白：氢氧化铝为1∶1)，并在第5、10天各重复致敏1次，共致敏3次，正常对照组在同等条件下腹腔注射生理盐水[4-5]。

1.2.1.3 豚鼠非免疫性接触性荨麻疹模型 豚鼠30只，按体质量随机分为模型对照组、氯雷他定组、消风止痒颗粒组，每组8只，雌雄各半。末次给药30 min后，用80%DMSO无水乙醇溶液均匀涂抹豚鼠右耳郭两面，100 μL/只，左耳在同等条件下涂抹生理盐水[6-7]。

1.2.2 给药方法

1.2.2.1 剂量设定 对照药氯雷他定片对小鼠、大鼠、豚鼠的临床等效剂量换算分别为1.84 mg/kg、0.93 mg/kg、0.72 mg/kg；消风止痒颗粒对小鼠、大鼠、豚鼠的临床等效剂量换算分别为16.50 g/kg、8.40 g/kg、6.45 g/kg。

1.2.2.2 小鼠免疫性接触性慢性荨麻疹模型给药方法 氯雷他定组和消风止痒颗粒组小鼠在致敏当天开始按照0.2 mL/10 g的剂量灌胃给药，正常对照组和模型对照组同等条件下给蒸馏水，1次/d，连续7 d。

1.2.2.3 大鼠免疫性非接触性慢性荨麻疹模型给药方法 氯雷他定组和消风止痒颗粒组大鼠从初次致敏后第6天开始按1 mL/100 g灌胃给予相应药物，连续给药9 d，正常对照组和模型对照组在同等条件下给予蒸馏水。

1.2.2.4 豚鼠非免疫性接触性荨麻疹模型给药方法 氯雷他定组和消风止痒颗粒组豚鼠按照1 mL/100 g灌胃给药，1次/d，连续7 d，模型对照组在同等条件下灌胃蒸馏水。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 小鼠免疫性接触性慢性荨麻疹模型检测指标与方法 1)各组小鼠分别于激发后1 h、6 h、24 h观察搔抓次数，每次连续记录10 min内搔抓次数。2)激发后24 h尾静脉注射0.5%伊文思蓝，观察注射后第1 h、6 h、24 h、48 h及72 h内背部暴露皮肤处风团出现的数量、消退时间，每次连续记录1 h。3)激发24 h后测双耳厚度(每侧3个点)；第7天双耳打孔各取3个耳片，称重。4)第7天各组小鼠摘眼球采血0.5 mL，静置2 h后，4 ℃下1 200×g离心10 min，吸取上清液，-80 ℃保存，分析待测。严格按照试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附试验法测定血清中IgE、组胺、5-HT含量。5)采血后的小鼠脱颈椎处死，剪开腹部皮肤，沿腹白线剪开腹壁约0.5 cm，向腹腔内注入台氏液，轻揉腹部3 min，剖开腹腔，吸出全部液体，置于离心管中[3]。低温超速离心机在4 ℃，1 000×g的条件下离心10 min，弃上清得肥大细胞沉淀物，加入台氏液混悬，滴加甲苯胺蓝染色液，混匀，染色30 min。吸取1滴染色后肥大细胞悬液于载玻片上，盖上盖玻片，待液体晾干后，置于倒置荧光显微镜下观察。先用10×物镜找到清晰视野下的细胞，再用20×物镜下进行肥大细胞观察与计数，按“弓”字形顺序依次计数100个肥大细胞，并计数其中脱颗粒的肥大细胞，计算脱颗粒百分率和抑制率[8]。肥大细胞脱颗粒率(%)=脱颗粒细胞数/肥大细胞总数×100%；肥大细胞脱颗粒抑制率(%)=(1-给药组的脱颗粒率/模型组的脱颗粒率)×100%。

1.2.3.2 大鼠免疫性非接触性慢性荨麻疹模型检测指标与方法 1)末次给药24 h后，各组大鼠经眼内眦采集血液2 mL于干净的EP管(微量离心管)中，4 ℃过夜，在4 ℃条件下1 200×g离心10 min，吸取上清液，-80 ℃保存，分析待测。严格按照试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附试验法测定血清中IgE、P物质的水平。2)大鼠经异弗烷麻醉后，剪开腹部皮肤，沿腹白线剪开腹壁约1 cm，向腹腔内注入台氏液，轻揉腹部3 min，剖开腹腔，吸出全部液体，置于离心管中。低温超速离心机在4 ℃，1 000×g的条件下离心10 min，弃上清得肥大细胞沉淀物，加入台氏液混悬，甲苯胺蓝染色，混匀，染色30 min。吸取1滴染色肥大细胞悬液于载玻片上，盖上盖玻片，待液体晾干后，置于倒置荧光显微镜下观察。先用10×物镜找到清晰视野下的细胞，再用20×物镜下进行肥大细胞观察与计数，按“弓”字顺序依次计数100个肥大细胞，并计数其中脱颗粒的肥大细胞，计算脱颗粒百分率和抑制率[9]。肥大细胞脱颗粒率(%)=脱颗粒细胞数/肥大细胞总数×100%；肥大细胞脱颗粒抑制率(%)=(1-给药组的脱颗粒率/模型组的脱颗粒率)×100%。3)摘取大鼠脾脏和胸腺，使用电子天平精密称定，按照公式计算各组大鼠脾指数和胸腺指数[10]。脾指数=脾脏重量(mg)/大鼠体质量(g)，胸腺指数=胸腺重量(mg)/大鼠体质量(g)。

1.2.3.3 豚鼠非免疫性接触性荨麻疹模型检测指标与方法 分别于涂抹DMSO后30 min、45 min、60 min、120 min、180 min用游标卡尺测量豚鼠左右耳郭外缘5 mm处3个固定点的厚度，测量结束后将3个点打耳片称重，求平均值，计算耳肿胀度。耳肿胀度(%)=(右耳重量均值-左耳重量均值)/左耳重量均值×100%。

2 结果

2.1 对小鼠免疫性接触性慢性荨麻疹模型的作用 小鼠在激发后出现前爪抓挠头面部，后爪抓挠耳朵，舔舐后肢与腹部等现象；模型对照组小鼠抓挠次数显著增加，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；氯雷他定和消风止痒颗粒均可不同程度减少小鼠抓挠次数，24 h后氯雷他定组，消风止痒颗粒组与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。各组小鼠在尾静脉注射伊文思蓝1 h后均出现蓝染风团，24 h后明显减少，48 h后基本消退，72 h背部蓝斑完全消退。模型对照组在1 h、6 h风团数明显增多，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；氯雷他定组和消风止痒颗粒组在1 h、6 h风团数明显减少，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；且消风止痒颗粒组小鼠背部蓝斑数量少于氯雷他定组。见表1。模型对照组小鼠双耳肿胀度与耳片重量显著升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；氯雷他定和消风止痒颗粒均能缓解小鼠耳肿胀，降低耳片重量，消风止痒颗组优于氯雷他定组，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

图1 不同时间各组小鼠抓挠行为的数量(n=10)

表1 不同时间小鼠背部蓝斑的数量变化

表2 对小鼠免疫性接触性慢性荨麻疹模型耳厚度及重量的影响

模型对照组小鼠血清中IgE、组胺及5-HT水平均明显升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；氯雷他定可明显降低血清IgE、组胺和5-HT的水平，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；消风止痒颗粒组仅降低了血清中5-HT的水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 各组小鼠血清IgE、组胺及5-HT水平比较(n=10)

小鼠腹腔肥大细胞正常形态为圆形、边缘光滑，甲苯胺蓝将肥大细胞胞质中的颗粒被染成紫红色，细胞核为浅蓝色；脱颗粒肥大细胞肿胀变形、边缘不整齐或颗粒自细胞膜内向外流出、颗粒颜色加深和出现空泡，则判断为脱颗粒阳性。

正常对照组小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒现象不明显，脱颗粒细胞的百分率为12.70%；模型对照组小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒现象明显，脱颗粒细胞百分率显著增加，为30.10%，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；氯雷他定和消风止痒颗粒均对小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒现象有明显的抑制作用，脱颗粒细胞百分率显著降低，氯雷他定对肥大细胞的脱颗粒抑制率优于消风止痒颗粒，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 氯雷他定与消风止痒颗粒对小鼠腹腔肥大细胞脱颗粒的影响

2.2 对大鼠免疫性非接触性慢性荨麻疹模型的作用 模型对照组大鼠血清IgE、P物质水平升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；氯雷他定可不同程度降低大鼠血清中IgE，P物质的水平，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；消风止痒颗粒对大鼠血清中IgE，P物质的水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组大鼠血清IgE和P物质水平的测定(n=10)

大鼠腹腔肥大细胞正常形态为圆形、边缘光滑，甲苯胺蓝将肥大细胞胞质中的颗粒被染成紫红色，细胞核为浅蓝色；脱颗粒肥大细胞肿胀变形、边缘不整齐，颗粒颜色加深且向膜外流出，则判断为脱颗粒阳性。正常对照组大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒现象不明显，脱颗粒细胞的百分率为12.30%；模型对照组大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒现象明显，且脱颗粒细胞的百分率显著增加为34.10%，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；氯雷他定组和消风止痒颗粒组大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒现象均有明显减轻，脱颗粒细胞的百分率显著降低分别为23.20%、24.10%，肥大细胞脱颗粒抑制率分别为31.96%、29.33%与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 氯雷他定与消风止痒颗粒对大鼠腹腔 肥大细胞的影响

本实验中，与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠胸腺指数和脾指数均有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型对照组比较，氯雷他定组和消风止痒颗粒组大鼠胸腺指数和脾指数均有趋于正常水平的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 各组大鼠胸腺指数和脾指数测定结果(n=10)

2.3 对豚鼠非免疫性接触性荨麻疹模型的作用 模型对照组豚鼠右耳在涂抹DMSO后各时间点耳肿胀明显，与其左耳比较差异有统计学意义(P<0.01)；氯雷他定在造模后30 min、45 min右耳的肿胀明显减轻，与模型对照组豚鼠右耳比较差异有统计学意义(P<0.05)。但60 min后，氯雷他定组豚鼠右耳与模型对照组豚鼠右耳相比之间无差异，凸显了氯雷他定可以快速发挥的药物特点；消风止痒颗粒在造模后45 min、60 min、120 min、180 min均可明显减轻右耳肿胀，与模型对照组豚鼠右耳比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，凸显出中药药效起效慢但药效维持作用时间久的药物特点。见表5。

表5 氯雷他定与消风止痒颗粒对豚鼠左右耳厚度的影响

模型对照组、氯雷他定组和消风止痒颗粒组豚鼠左耳涂抹生理盐水后，重量无差异；涂抹DMSO 180 min后，模型对照组豚鼠右耳重量显著增加，与模型对照组左耳比较差异有统计学意义(P<0.05)；氯雷他定组豚鼠右耳重量与模型对照组右耳比较有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；消风止痒颗粒组豚鼠右耳重量与模型对照组右耳比较差异有统计学意义(P<0.05)；且消风止痒颗粒组豚鼠的耳肿胀度低于氯雷他定组。见表6。

表6 氯雷他定与消风止痒颗粒对豚鼠左、右耳重量的影响

3 讨论

荨麻疹属中医学“瘾疹”范畴，古籍中即提出风邪与荨麻疹发病密切相关。《诸病源候论·风瘙身体瘾疹候》云：“人皮肤虚，为风邪所折，则起瘾轸。”《千金要方·论杂风状》云：“风邪客于肌肤，虚痒成风疹瘙疮。”患者卫气不固复又外感风邪，正气无力鼓邪外出，致急性期风邪留于肌表，短期则闭郁肺气，致肺气失宣，总属气分；长期则由肌表入经络，致营卫不和、气滞血瘀，归于血分。因风性开泄，易袭阳位，故荨麻疹常发于头面部、背部等部位，且风邪“善行而数变”，故荨麻疹常突发突止，发无定处，反复发作，此起彼伏，伴瘙痒难耐[11]。

目前临床治疗慢性荨麻疹多以抗组胺药为主，第1代抗组胺药对中枢神经有明显的抑制作用，而止痒效果维持时间短，易引起不良反应，目前已不再使用。第2代抗组胺药镇静作用弱，无抗胆碱与心脏毒性，且不良反应小，已成为治疗慢性荨麻疹的一线用药[12]，如西替利嗪、氯雷他定、阿伐斯汀等。本研究所用氯雷他定片为长效三环类抗组胺药，是一种选择性外周H1受体拮抗剂。通过抑制组胺、多种白细胞介素、肿瘤坏死因子-α等炎症介质的释放，从而减缓过敏反应引起的各种症状，短期内有一定疗效[13-14]。

消风止痒颗粒由防风、蝉蜕、地骨皮、苍术(炒)、亚麻子、当归、地黄、木通、荆芥、石膏、甘草共11味中药相互协同共达消风清热，除湿止痒之功，主治丘疹样荨麻疹，也用于湿疹、皮肤瘙痒症。方中防风、荆芥二者均味辛性微温，温而不燥，长于发表散风，都可用于风疹瘙痒；地黄、地骨皮清热凉血、除蒸，当归、亚麻子补血活血、养血祛风、润燥通便；苍术燥湿健脾，祛风散寒；蝉蜕疏散风热，透疹止痒；木通善清心火，利尿通淋，石膏善清肺热，除烦止渴；甘草清热解毒，调和诸药。据现代药理分析，方中多味药物具有免疫调节作用，对变态反应有良好的治疗作用[15-16]。

血清IgE作为介导Ⅰ型变态反应的主要抗体，在变态反应性疾病中起关键作用。当变应原首次侵入机体，诱导特异性B细胞产生IgE，抗体中的Fc段会与嗜酸性粒细胞或肥大细胞表面的FcεRI的α亚基结合，使机体处于致敏状态[17]。当相同抗原再次入侵机体时，便与已经结合在致敏靶细胞上的IgE特异性结合，导致细胞脱颗粒和血管活性介质释放，引起毛细血管扩张、通透性增强，血管内组织液进入真皮形成真皮水肿，进而形成风团[18-19]。此外，已有研究证实P物质可引发皮肤瘙痒和风团反应，诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，以及增强肥大细胞对各种刺激的反应性，提示P物质参与了慢性荨麻疹的发病。肥大细胞自身就能分泌P物质，P物质又反过来作用于肥大细胞和血管，从而促使P物质不断释放，形成病症的持续状态[20]。

本实验发现，在免疫性接触性/非接触性慢性荨麻疹模型实验中，实验动物在造模后明显出现腹腔肥大细胞脱颗粒，皮肤出现风团，抓挠、舔舐、耳肿胀等现象。氯雷他定和消风止痒颗粒均可明显抑制致敏动物模型肥大细胞活化，脱颗粒现象。氯雷他定能有效地减少组胺、IgE、P物质、5-HT等炎症介质的释放，进而缓解由慢性荨麻疹造成皮损血管扩张引起的皮肤瘙痒、风团、水肿性斑块等症状。在非免疫性接触性荨麻疹模型试验中，消风止痒颗粒无论在耳肿胀度还是耳厚度的测量结果均优于氯雷他定，药效明显且缓解变态反应肿胀症状的作用持久。由此推断，氯雷他定对免疫性慢性荨麻疹有良好的治疗效果，可迅速发挥药效，快速抑制炎症介质的释放，缓解瘙痒症状。消风止痒颗粒则对接触性荨麻疹有明显的治疗作用，该方可解表、祛风止痒兼能清热、透疹、利水，达到缓解皮肤红肿，抑制风团之效。本实验为氯雷他定和消风止痒颗粒的临床合理用药提供药效学依据。