HPLC法同时测定四粒红花生衣药材中原儿茶酸和儿茶素的含量

胡 洋，王 燕，马晓静，王丹彧△

(1.第964医院第二门诊部，吉林 长春 136002；2.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000)

花生衣为豆科植物落花生AraehishypogaeaL.的成熟种子的种皮，应用于中成药益血生胶囊(片)、复方红衣补血口服液和血宁糖浆中。花生衣性平，味甘、微苦、涩，可养血止血，适宜贫血及各种出血性疾病。目前，由于花生衣无国家标准，落花生育种技术的更新，其新品种层出不穷，各省市对其药材质控差异较大。花生作为吉林省四大经济作物之一，其独特的品种为四粒红，在网络平台及社会上收到消费者的青睐。目前侧重于花生衣药材中化学成分及色素的研究报道较多，如：有报道从花生衣中分离出对羟基苯甲酸、原儿茶酸、原儿茶酸甲酯、儿茶素等化学成分[1-4]，而对四粒红类花生衣的研究报答较少，本研究参考文献[5-11]，建立了四粒红类花生衣中原儿茶酸和儿茶素的液相色谱测定法，为吉林省特有品种四粒红类花生深度开发应用提供基础，为四粒红类花生衣质控提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Agilent 1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；BT125D型电子天平(赛多利斯公司)、 原儿茶酸(批号：110809-201906，含量：97.7%)、儿茶素(批号：110877-202005，含量：95.1%)均购于中国食品药品检定研究院。乙腈及甲醇为色谱纯，水为超纯水。药材来源见表1，均为产地收集，由吉林农业大学包海鹰教授鉴定。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 采用Agilent TC-C18(4.6×250 mm，5 μm)为色谱柱，以乙腈-0.3%磷酸(10∶90)为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长270 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 混合对照品溶液 取原儿茶酸、儿茶素对照品各约10 mg，精密称定，分别置20 mL量瓶中，加50%的甲醇稀释至刻度，分别得到原儿茶酸、儿茶素对照品储备液。精密量取原儿茶酸对照品储备液1 mL，儿茶素对照品储备液5 mL，置于同一50 mL量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含原儿茶酸10 μg，儿茶素50 μg的混合溶液，即得。

1.2.2.2 供试品溶液 取本品粉末(过三号筛)约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.3 系统适用性试验 分别取混合对照品溶液、样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相同保留时间处检出相同的色谱峰，且与其它组分能达到基线分离，分离度良好，见图1。

图1 高效液相色谱图

1.2.4 线性关系考察 分别精密取标准储备适量，用50%甲醇稀释制成每1 mL含原儿茶酸4.73 μg、9.46 μg、14.19 μg、18.92 μg、23.65 μg；含儿茶素27.08 μg、54.16 μg、81.24 μg、108.32 μg、135.40 μg的混合标准系列溶液。按照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，各对照品浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，进行线性回归，得原儿茶酸线性方程Y=26.353X+1.15，r=0.999；得儿茶素线性方程Y=5.0299X+1.81，r=0.999；结果表明原儿茶酸在4.73～23.65 μg·mL、儿茶素在27.08～135.40 μg·mL-1的范围内线性关系良好。

1.2.5 重复性 取同一花生衣样品(HSY-1)分别精密称取6份，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，结果原儿茶酸的含量为0.10 mg· g-1，RSD为0.9%；儿茶素的含量为0.74 mg· g-1RSD为0.8%，结果表明该方法重复性良好。

1.2.6 稳定性 取上述重复性试验项下同一供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下分别在0、2、4、6、8、16 h测定，记录峰面积考察溶液稳定性，结果显示原儿茶酸的RDS为1.4%，儿茶素的RSD为1.1%，表明该溶液稳定性良好。

1.2.7 回收率试验 精密称取已知含量的同一样品(HSY-1)约2.0 g，共6份，按照1∶1的比例加入对照品溶液，按照2.2.2项下制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，结果原儿茶酸的回收率为97.93%，RSD=1.7%；儿茶素的回收率为96.65%，RSD=1.9%。

2 结果

2.1 样品测定 取10批四粒红花生衣药材，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定，测定结果见表1。

表1 红四粒样品含量测定结果

3 讨论

3.1 测定波长的选择 本研究对原儿茶酸及儿茶素对照品和供试品溶液在200～400 nm的波长处进行扫描，原儿茶酸在260 nm处有最大吸收、儿茶素在278 nm处有最大吸收，同时样品溶液与对照品溶液吸收光谱相同。综合样品中两个主成分的含量、峰面积及其他物质的影响选择在270 nm的波长处进行测定。

3.2 提取条件的筛选 本研究分别比较了不同浓度的甲醇、料液比、超声时间，以原儿茶酸和儿茶素含量的和为考察指标，最终确定四粒红类花生衣中原儿茶酸和儿茶素的最佳提取工艺为：样品2 g加50%甲醇的25 mL超声处理30 min，不仅操作简便、方便，又能提取完全。

3.3 色谱条件的选择 本研究分别比较了乙腈-水和乙腈-0.3%磷酸为流动相时的色谱行为，研究结果表明，使用乙腈-水为流动相时儿茶素色谱峰能达到较好的基线分离，但是原儿茶酸色谱峰与杂质峰分离效果较差，且原儿茶酸峰有拖尾现象，当改用乙腈-0.3%磷酸为流动相时，两个色谱峰基线平稳且均能到达较好的分离，最终选择乙腈-0.3%磷酸(10：90)为流动相。