金刚丸对绝经后骨质疏松模型大鼠NF-κB p65表达及IL-1、IL-6、TNF-α的影响*

陈 杰，沈琳玲，戎 宽，朱亮亮，叶子丰，匡浩铭，匡建军

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006)

绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是生活中十分常见的一种疾病，好发于更年期后的绝经后女子，由于女子在绝经后卵巢功能逐步萎缩，导致雌激素释放能力降低、内分泌发生改变，可引起骨量丢失、骨强度降低、骨组织结构损坏、骨质易脆，骨折风险风险明显增高[1]。当妇女体内雌激素水平下降，引起相关免疫反应增强、T细胞增殖，炎症因子大量分泌[2]，大量研究表明[3]IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子对破骨细胞的生成与活化起着重要作用，同时亦有研究表明[4]NF-κB家族是与破骨细胞的生成与活化密切相关。由于PMOP西药治疗有一定的不良反应，开展PMOP的中医药治疗有着深远意义。在中医理论中PMOP症属“骨痿”，病机以肾虚为主，当治以补肾壮骨。金刚丸在临床应用中，治疗PMOP疗效较好。本研究通过去卵巢法建立绝经后骨质疏松模型，观察金刚丸对其血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量及NF-κB p65表达的影响，以探索金刚丸治疗PMOP的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用56只6月龄SPF级Sprague-Dawley(SD)未经产雌性大鼠，体重(300±20)g，动物来源：湖南省中医药研究院实验动物中心，动物许可证号批号：43602500000352。

1.2 实验药物 金刚丸：具有补肾生津、温阳益髓之功。将酒浸肉苁蓉、酒浸菟丝子、盐炒杜仲、萆薢各120 g等分为细末，随后通过与酒煮猪腰子蜜制成丸。(药物来源：陕西天洋制药有限公司生产；药品批准文号：Z61020726，丸剂，成人剂量：每日2次，每次1丸，每丸3.5 g)。戊酸雌二醇片(法国 DELPHARM Lille S.A.S.生产；药品批号：219A；成人剂量：每日1次，每次1粒，每粒1mg)。

1.3 实验试剂 10%水合氯醛(上海山浦 批号：20191016)、IL-1试剂盒(酶联生物 批号：ml037373)、IL-6试剂盒(酶联生物 批号：ml102828)、TNF-α试剂盒(酶联生物 批号：ml002859)、P65抗体(英国abcam 批号：ab16502)、石蜡(Sigma)、中性树胶(Sigma)、苏木素(Wellbio)、PBS(7.2-7.6)(Wellbio)、伊红(Wellbio)。

1.4 实验仪器

名称厂家全称货号台式高速冷冻离心机湖南湘仪H1650R摇床中国江苏其林贝尔TS-1电泳仪中国北京六一DYY-6C转膜仪中国北京六一DYCZ-40D磁力搅拌器中国雷磁JB-13普通冰箱中国奥克斯BCD-196A电磁炉荷兰飞利浦HD4925精密PH计中国雷磁PHS-3C电子天平美国双杰JJ224BC化学发光成像系统广州勤翔Chemiscope6100

1.5 方法

1.5.1 造模方法 模型组：用百分之十水合氯醛(0.3 mL/100 g)，针对40只雌性SD大鼠采用腹腔内麻醉的方式来展开实验。在手术台上用剃毛器备皮后进行消毒。在大鼠最下的肋骨水平、腹中线左/右侧旁开2～3 cm做一竖行切口，在进入腹腔后可以发现一乳白色脂肪团，钝性剥离后找到卵巢。在子宫及卵巢之间，用手术线结扎后摘除卵巢。假手术组：8只大鼠做同样的手术切口，切除同等重量脂肪组织后立即缝合切口。术后连续3天，予以每只手术大鼠8万单位青霉素(1次/天)防止感染。

1.5.2 分组方法 进行1周适应性喂养后，把56只SD大鼠划分为空白组(NtCn=8)、假手术组(SHAMn=8)、去势大鼠组(OVXn=40)。模型验证完成后，采用随机数字表法把40只去势大鼠均等的划分为模型组、戊酸雌二醇组、金刚丸低剂量组、金刚丸中剂量组、金刚丸高剂量组共5组大鼠。

1.5.3 干预方法 各组每天上午灌胃给药1次，根据《药理实验方法学》[5]中的方法，依据人类和大鼠表面体积存在差异来进行有效核算。具体方案如下：

组别生药含量水溶液含量戊酸雌二醇组0.09mg·kg-1·d-10.009mg·mL-1金刚丸低剂量组1.8 g·kg-1·d-10.18 g·mL-1金刚丸中剂量组3.6 g·kg-1·d-10.36 g·mL-1金刚丸高剂量组7.2 g·kg-1·d-10.72 g·mL-1

对假手术组、空白组、模型组大鼠采用1 mL/100 g的蒸馏水灌胃。各组一共灌胃治疗12周，每周6天，密切监测体重变化，及时调节给药剂量。

1.5.4 标本制作方法 给药后12周取材。用水合氯醛实施麻醉后，开腹找到腹主动脉，使用真空采血管收集血液标本。把收集的全血标本放置于室温中静置，离心后收集血清以用于检测。随后剪断大鼠腹主动脉，再取双侧胫骨，以4%中性多聚甲醛固定，封口袋密封后保存备用。

1.6 实验指标测定 用HE染色法观察骨组织形态，ELISA法检测血清IL-1、IL-6、TNF-α含量，Western Blot法检测大鼠股骨NF-κB p65的表达。

2 结果

2.1 金刚丸对大鼠骨组织形态的影响 HE染色结果显示：正常组和假手术组骨小梁形态完整、无明显断裂，骨髓腔正常，骨细胞排列均匀；模型组骨小梁形态模糊、广泛断裂，骨髓腔增宽，骨细胞排列散乱；戊酸雌二醇组、金刚丸高、中、低剂量组可见骨小梁形态较模型组改善、结构较为紧密，骨髓腔减小，骨外膜排列较为齐整。见图1。

图1 金刚丸对大鼠骨组织形态的影响(HE，×100)

2.2 金刚丸对大鼠血清TNF-α的影响 相较于空白组和假手术组对比分析而言，模型组及各给药组血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均上升，差异有统计学意义(P<0.05)；相较于模型组相对比分析而言，各给药组血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；相较于戊酸雌二醇组、金刚丸中、低剂量组比较分析而言，金刚丸高剂量组血清IL-1、IL-6、TNF-α含量显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；金刚丸高剂量组与其余各给药组相比较而言，对血清IL-1、IL-6、TNF-α的抑制作用更为突出。见表1。

表1 金刚丸对大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α的影响

2.3 金刚丸对大鼠股骨NF-κB p65表达的影响 相较于空白组和假手术组对比分析而言，模型组股骨p65含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；相较模型组对比分析而言，各给药组股骨p65含量均有所下降，其中戊酸雌二醇组、金刚丸高剂量组下降明显，差异有统计学意义(P<0.05)。金刚丸高、中、低剂量组组间比较，高剂量组股骨p65含量比中剂量组低，差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组股骨p65含量比低剂量组低，差异有统计学意义(P<0.05)。随着金刚丸药物浓度的升高，股骨p65含量呈下降趋势。见表2、图2。

表2 金刚丸对大鼠股骨NF-κB p65表达的影响

图2 金刚丸对大鼠股骨组织中蛋白电泳的影响

3 讨论

PMOP随着中国老龄化加剧发病率也随之快速升高，越来越多的中老年绝经后女性遭此病困扰。当女性绝经后机体内雌激素分泌量会迅速降低，进而引起骨代谢紊乱、骨量减少、骨脆性增加，其临床表现多样，以全身关节疼痛、骨骼退化变形、脆性骨折最为常见[6]。由骨形成和骨吸收构成的骨重建，发生于人体生命的每个阶段，当破骨细胞超过成骨细胞主导的骨形成后OP随即发生。在正常人体代谢过程中，成骨与破骨所需时间完全不同，相较于破骨细胞而言成骨细胞需要消耗更多的时间才能有效的实现同等量的骨形成[7]。因此抑制破骨细胞活性、降低破骨细胞功能、减少骨吸收在抗骨质疏松治疗过程中占重要地位。依据大量研究得到结果显示[8-9]，IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子和NF-κB信号通路对于调节骨细胞功能以及促进机体机能具有重要的现实意义。

绝经后女性卵巢功能减退，体内雌激素分泌骤然减少，相关免疫活动随之增强，大量炎性因子被释放到体内，机体长期处于慢性炎症环境之中[10]。有研究显示[3]，炎性因子促进骨吸收的机制可能在于其作用于间质干细胞和破骨细胞前体，加快了破骨细胞分化成熟。IL-1、TNF-α均可诱导核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)分泌增加，核因子-κB受体活化因子(RANK)与RANKL结合后可激活NF-κB信号通路，促使破骨细胞成熟。IL-6对PMOP有着双重调节作用，既能增强骨的形成，也能促进骨的吸收，总的来说，促进骨吸收作用大于骨形成[11]。NF-κB是体内调控细胞增殖分化及炎症的重要转录因子，NF-κB信号通路在没有被激活时，NF-κB抑制因子IκBα与NF-κB紧密结合在一起，分布于胞质中。当RANKL与RANK相结合后在受体因子的影响作用下IκBα激酶 IKKs被活化，IKKs分解IκBα，促使其与NF-κB分离，NF-κB随即移动到细胞核内，能够参与到骨细胞的生长调节中[12]。NF-κB家族有五个成员，NF-κB p65是其中之一，有研究表明[13]：NF-κB p65与骨密度(BMD)呈负相关。因此，NF-κB p65在绝经后骨质疏松的病理过程中起到了重要作用，它将可能成为研究药物对PMOP治疗作用的新靶点。

PMOP是现代医学上的名称，中医典籍中尚未找到该疾病名称的明确记录，根据全身骨痛、乏力、肢体痿软等临床表现，“骨痹”、“骨痿”的症状与其十分相似。结合脏腑、八纲、气血精液辨证，该病涉及肾、肝、脾等多个脏腑，病机总属本虚标实，肾精亏虚、肝郁血虚在中医中属于常见的虚证证型，其中肾精亏虚尤为紧要[14]。肾主骨，乃先天之本，肾精充沛则髓化生有源，骨质得养[15]。石敏等研究[16]指出：中医“肾”在临床中能够显著地作用于OPG/RANK/RANKL等信号通路并直接参与到调解中，骨的生长发育和代谢与其之间是密切关联的，肾精亏虚则骨髓化生无源，导致PMOP发生。金刚丸是补肾经典方，全方包含的中药材为肉苁蓉、菟丝子、杜仲、萆薢、酒煮猪腰。菟丝子性味辛甘，有补肾益精填髓的作用，现代药理学研究发现[17]：其主要活性成分菟丝子黄酮可通过下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2、OPG蛋白表达，进而抑制成骨细胞凋亡；肉苁蓉味甘咸、性温，有补肾阳益精血的功效，朱刚等[18]研究发现：肉苁蓉醇提物可以上调OP模型大鼠骨钙素、钙离子及血清碱性磷酸酶水平，进而提高大鼠股骨生物力学功能；杜仲性味甘温，入肝肾经，善于补肝肾、强筋骨，研究发现[19]：杜仲不仅能促进成骨细胞活化进而促进骨形成，且可以遏制炎症因子活性，降低其对骨破坏的诱导作用；萆薢味苦，善于分清泄浊，祛肾浊而留肾精，药理研究[20]认为其可从分子水平对成骨细胞UMR106促增殖活，抑制破骨样多核细胞形成；配猪腰子血肉有情之品，暖肾以补先天之气，酒煮后助行药力，加强补肾功效。诸药联合，共同发挥补肾健骨、填精生髓的功效。

本研究采用3个梯度的金刚丸浓度及阳性对照药戊酸雌二醇片干预模型大鼠，在干预12周后检测大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量及股骨组织中NF-κB p65的含量。研究结果显示，戊酸雌二醇组、金刚丸高、中、低剂量组可见骨小梁形态较模型组改善、结构较为紧密，骨髓腔减小，其中金刚丸高剂量组改善明显，骨外膜排列整齐。可见金刚丸可明显改善骨组织形态。金刚丸能降低大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量和股骨组织NF-κB p65的蛋白表达，降低骨质疏松大鼠炎症程度，参与调控成骨细胞与破骨细胞的增殖和分化，这可能是金刚丸能够缓解PMOP临床症状的重要因素。且其作用对于金刚丸呈现一定剂量依赖性。总而言之，本研究证实金刚丸能降低IL-1、IL-6、TNF-α含量、下调NF-κB p65表达水平，其治疗作用与药物浓度呈正相关，初步阐释了金刚丸抗骨质疏松的作用机制。