基于网络药理学的山豆根抗炎活性成分辨析与靶点预测*

周沁阳，赵景云

(1.中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198；2.云南省中医中药研究院，云南 昆明 650223)

山豆根为豆科植物越南槐 Sophora Tonkinensis Gagnep(STG)的干燥根和根茎。2020年版《中国药典》中记载山豆根性味苦，寒，有毒；具清热解毒，消肿利咽之功，用于火毒蕴结，乳蛾喉痹，咽喉肿痛，齿龈肿痛和口舌生疮[1]。山豆根用药历史悠久，临床运用广泛，具有较高药用价值和经济价值。研究发现山豆根中化学成分主要包括生物碱、黄酮、多糖和三萜和芳香类化合物等，具有抗乙肝和人免疫缺陷病毒、抗氧化、抗肿瘤、保肝、提高免疫力、降压以及解痉止泻等生物活性[2-3]。2020年版《中国药典》以苦参碱(matrine)和氧化苦参碱(oxymatrine)作为其质量控制指标。

炎症反应(inflammation)是一系列损伤因子引起具有血管系统的活体组织产生主动性的防御，多种疾病的发病与此有关[4]。炎症反应是很多疾病，包括动脉粥样硬化、缺血性脑卒中和炎症性肠病等的病理基础[5-6]。现代药理学研究显示，大部分苦参碱型生物碱具有明显镇痛抗炎活性，其中镇痛作用较强的为苦参碱和槐定碱，对耳肿胀抑制作用较强的为槐果碱、氧化苦参碱和鹰爪豆碱[7]。观察山豆根颗粒及其饮片对LPS小鼠急性炎症模型，小鼠血清NOS、NO、MDA、TNF-α和IL-6等含量的影响，提示山豆根颗粒及其饮片各剂量均能显著抑制小鼠足肿胀度[8]。山豆根水提组分对混合致炎液所致咽喉实热证模型小鼠耳肿胀具有较强抑制作用[9]。山豆根药代动力学研究表明，其水提物能以剂量依赖性，对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型发挥抗炎作用，且药效与体内苦参碱系统暴露量成正相关[10]。山豆根主要成分之一槐果碱能够抑制LPS介导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应，其机制可能与干预NF-κB信号通路有关[11]。最近研究发现，苦参碱氯化钠注射液能够有效缓解新型冠状病毒肺炎(doro-navirus disease 2019，COVID-19)模型小鼠的肺部损伤，降低其肺组织中病毒核酸载量和相关炎症介质水平，提高外周血淋巴细胞比例[12]。以上文献回顾提示，山豆根及其效用成分具有良好的抗炎作用。

针对中药具有多成分，作用多靶点以及多通路的特点，近年来应运而生的网络药理学，旨在研究药物、疾病、靶点和通路之间相互作用关系，研究建立“成分-靶点-通路”网络，分析预测多种药物成分在体内的互作关系[13]。网络药理学强调药物作用通路的多靶点与多途径，与中药治疗疾病的原理相契合，为传统中医药现代化发展提供了新思路。本研究将采用网络药理学研究方法，对山豆根抗炎活性成分以及潜在靶点进行研究探讨，为进一步诠释其可能的抗炎作用机制，促进临床合理用药以及相关药物研发等拓展新思路，并提供相应理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件 化合物数据库PubChem(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；整合型生物信息及疾病基因数据库GeneCards(https：//www.genecards.org/)；疾病靶点标准化数据库Uniprot(https：//www.uniprot.org/)；中药系统药理学分析平台TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；药效团匹配与潜在识别靶标平台PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；蛋白互作数据库String(https：//string-db.org/)；富集分析数据库DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)；R语言4.1.2软件；Cytoscape 3.8.0软件。

1.2 药物相关抗炎活性成分及药物靶点筛选 在TCMSP搜索引擎中输入“山豆根”进行检索得到目标化合物信息，在TCMSP数据库中设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%和类药性(drug-likeness，DL)≥ 0.18作为化合物筛选条件。在Pubchem中输入对应化合物的CAS号，下载其sdf格式文件。将对应化合物的sdf格式文件导入PharmMapper网站，仅从人类蛋白靶点数据中进行匹配(Human Protein Targets Only)，得到化合物潜在靶点，下载数据文件备用。

1.3 疾病靶点筛选与靶点标准化 通过GeneCards数据库以疾病名称“Inflammation”进行检索，得到炎症疾病相关靶标。利用Uniprot数据库分别上传得到的药物潜在靶点与疾病靶点名称，蛋白种属设置为智人“homo sapiens”，获取其靶点的标准基因名。将二者相互映射，得到山豆根抗炎活性成分潜在靶标。

1.4 药物靶蛋白—疾病靶蛋白网络的建立与拓扑分析 将筛选得到的共有靶标上传至String平台，选择“multiple proteins”，蛋白种属及背景设为“homo sapiens”，以最高置信度位筛选条件“highest confidence(≥0.9)”进行筛选，建立“药物靶蛋白—疾病靶蛋白”(PPI)相互作用网络，得到PPI相互作用关系网络并下载备用。将文件导入Cytoscape 3.8.0软件，使用内置插件CytoNCA，Centralities项下除“degree”外全部选取并进行拓扑分析，导出分析结果，以点度中心性(Degree Centrality，DC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和中介中心性(Betweenness Centrality，BC)筛选核心靶点。

1.5 “成分-靶点-通路”可视化网络的建立 以PPI结果筛选出的潜在靶点、活性成分建立属性和网络Excel表格文件以作对应关系。将两个文件导入Cytoscape3.80软件，删除未匹配的节点，以“度”值(degree)大小对各节点进行排序，以颜色深浅和大小注释度值大小，颜色越深，节点大小越大，代表其与其它节点之间关联越紧密，建立“成分-靶点-通路”网络图。

1.6 基因富集和通路富集分析 将上述筛选出的PPI网络核心靶标导入DAVID 6.8数据库中，选择“OFFICE_GENE_SYMBOL”，“gene list”下选“homo sapiens”即进行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析以及GO(Gene Ontology)生物富集分析，对其可能存在的生物过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组分(Cellular Component，CC)进行分析。下载数据文件，将相关性较高的结果使用R语言进行数据可视化。

2 结果

2.1 山豆根抗炎活性成分筛选 通过以“山豆根”为关键词在TCMSP数据库平台进行检索，OB ≥ 30%和DL≥0.18作为筛选条件，最终得到15个潜在活性成分，包括多种生物碱和黄酮类等化合物，其信息见表1。

表1 山豆根抗炎活性成分基本信息

2.2 山豆根抗炎靶点筛选 通过PharmMapper网站得到15个化合物的潜在靶点基因，去除重复后共682个。通过GeneCards数据库以“Inflammation”进行检索，得到炎症疾病靶标共10945个。利用Uniprot数据库获取靶点和疾病靶点的标准基因名。将潜在活性成分与靶点相映射，得到山豆根活性成分抗炎潜在靶标共416个(图1)。

图1 “疾病-药物”共有靶点筛选

2.3 GO和KEGG分析及“成分-靶点-通路”网络可视化 利用DAVID 6.8数据库，将山豆根抗炎靶基因进行上传，并限定条件进行GO及KEGG信号通路的富集分析。按P值排序，并筛选确定前10的BP、MF和CC(表2)，利用R语言进行生物信息分析可视化(图2)，以外圈颜色深浅代表条目置信度，以内圈柱形长短代表富集程度。GO富集分析显示，共同靶点主要涉及的生物学过程包括对凋亡的负调控、对缺氧的反应和对外源刺激的反应等；主要分布于细胞质、外泌体和细胞胞外等结构中；主要涉及的分子功能过程包括识别蛋白质的结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性和丝氨酸型内肽酶活性等(表2)。通过KEGG通路富集分析结果显示，以P进行排序，山豆根抗炎活性成分涉及的通路可能主要包括Hif-1α、细胞凋亡等信号通路(图3)。对筛选出的靶点、活性成分以及通路建立“成分-靶点-通路”网络图(图4)。

图2 GO富集分析主要条目

图3 KEGG通路富集分析结果

图4 “药物-靶点-通路”网络图

表2 GO富集分析主要条目

2.4 PPI与拓扑分析结果 将共有靶标导入Cytoscape 3.8.0软件中，使用内置的CytoNCA软件进行拓扑分析，以DC，CC和BC为拓扑学指标，各取其排序前10位的结果，取3种拓扑分析方式共有的交集基因作为山豆根治疗炎症的核心靶点(图5)，包括原癌基因非受体酪氨酸激酶SRC，丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、热休克蛋白90α(heat shock protein 90 alpha，HSP90AA1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT1和大肠杆菌碱性磷酸酶(E.coli Phosphatase Alkaline，PHOA)。

图5 拓扑分析结果通路富集分析结果

3 讨论

山豆根始载于宋《开宝本草》，“味甘，寒，无毒”；《本草求真》载其为“解咽喉肿痛第一要药”[14]。最早的本草文献记载“出广南”，为广西和云南的道地药材，也是山豆根片(口服液)和抗病毒颗粒等40多种中成药生产的主要原料。自1963年版《中国药典》首载“广豆根”以来，此后为历版药典收载。此外，山豆根也是喀斯特石漠化贫困山区脱贫致富重要的药材资源之一。

临床前研究和临床实践中，发现山豆根具有良好的解热抗炎作用，但其中主要的抗炎效用成分尚不完全明晰。本研究通过网络药理学的山豆根抗炎活性成分和潜在靶点分析，共筛选到15个潜在抗炎活性成分，包括苦参碱、槐果碱和异鼠李素等成分，认为是山豆根发挥抗炎效用的主要成分。这些成分主要参与到对凋亡的负调控、对缺氧的反应和对脂多糖的反应等生物学过程中。通路富集结果显示，HIF-1信号通路、细胞凋亡通路、Ras信号通路和Toll样受体信号通路等被显著富集。通过拓扑分析发现，山豆根抗炎活性成分可能主要作用于SRC、MAPK1和Akt1等主要靶点，发挥抗炎作用。

缺氧和炎症反应关系密切。缺氧诱导因子HIF-1是一种在缺氧状态下特异性发挥活性的转录因子，广泛存在于哺乳动物和人体内，由α和β两个亚单位组成的异源二聚体。HIF-1α(HIF1A)具有氧不稳定性的特点。在正常细胞中，HIF-1α通过蛋白酶的脯氨酰羟化和泛素化降解，而缺氧会干扰泛素化过程而使HIF-1α得到积累，继而HIF-1α迁移到核内与HIF-1β结合，形成复合物启动下游包括经典炎症信号NF-κB在内的基因通路表达。研究认为在缺氧条件下巨噬细胞中的HIF-1α水平会升高，进一步加剧巨噬细胞所介导的炎症反应[15]。过表达HIF-1α会延迟炎症反应的消退，其机制可能与中性粒细胞凋亡被抑制有关。本研究发现，山豆根抗炎活性成分可能参与到HIF-1信号通路中发挥作用。

酪氨酸蛋白激酶Src，属于受体型酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)家族成员，是一类由多种细胞外信号分子激活的蛋白酪氨酸激酶，Src通过磷酸化修饰调控自身活性并向下传递信号。Src蛋白激酶是PI3K的活性激动剂，在LPS刺激下，能通过PI3K信号通路增加p47phox活性，刺激NADPH氧化酶产生O2·-；并且抑制Src蛋白激酶磷酸化后，可拮抗LPS介导的巨噬细胞炎症反应，减少巨噬细胞炎症因子合成和分泌[16-17]。既往研究发现，异鼠李素(STG1)能通过抑制Src的表达，从而起到缓解结肠炎的作用[18]。也有研究发现，苦参碱(STG12)能通过靶向阻断Src激酶结构域中Tyr419的自磷酸化，抑制Src激酶活性，进而下调MAPK/ERK信号通路的活化水平，从而抑制癌细胞的过度增殖[19]。MAPK信号通路中包含ERK、JUK和p38等MAPK亚族，MAPK在介导炎症反应和细胞因子生成中发挥关键作用[20]。相关文献回顾性研究提示，异鼠李素(STG1)能够调节NF-κB和MAPK等信号通路的激活，调控炎症相关细胞因子的表达，在多种炎症性疾病中发挥重要作用[21]。苦参碱(STG12)能够诱导p38的磷酸化，促进Nrf-2的入核，提高HO-1/NADPH的表达水平，在体内和体外抑制细胞内活性氧的产生并抑制内皮细胞凋亡，并且该效应能被MAPK抑制剂所阻断，提示苦参碱至少部分通过MAPK通路发挥抗内皮细胞凋亡作用[22]。蛋白激酶B PKB也称Akt，哺乳动物细胞表达3种Akt亚型(Akt1、Akt2和Akt3)，Akt1在心血管系统中调节多种功能，在血管生成、细胞凋亡和心肌肥大的调节中发挥重要作用[23]。在ApoE-/-小鼠上，Akt1基因的缺失会导致更严重的动脉粥样硬化病变，包括血管狭窄，纤维帽变薄，更严重的炎症反应等[24]。槲皮素(STG15)能够抑制TGF-β1/Smads和Akt信号激活，减弱肝星状细胞活化，抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化从而减轻肝损伤[25]。

基于相关文献回顾性研究提示和思考，结合本研究结果分析认为，未来进一步明确山豆根抗炎和其他药理效用的关键，应充分融合包括药剂学和药代动力学等不同学科特点，辨析不同属地山豆根的药理活性与其中各物质的量-效关系，考察各物质之间是否存在协同作用，以整体观解析山豆根中不限于此研究中筛选出的各物质对疾病的干预效果。本研究一定程度上揭示了山豆根能通过多靶点、多途径共同调控炎症的物质基础和可能的作用机制，为其临床合理运用以及相关药物研发等提供了相应理论基础和科学依据。