复合多肽制剂对肉鸡免疫功能的影响

李 程，田向学，李秀丽*，邱大勇，任卫科，赵 阳，李富强，高旭盟，董志民，孟恒星

(1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.农业农村部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站，天津 300381；3.天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津 300381；4.天津奥康普尼生物医药科技有限公司，天津 300381)

随着肉鸡集约化养殖的发展，因饲养密度增加而导致的生产应激不断上升，导致肉鸡免疫功能下降。同时，一些细菌性因素包括支原体、大肠埃希氏菌感染等，病毒性疾病如鸡新城疫、禽白血病、网状内皮增生症和传染性法氏囊病等，以及营养不良、抗菌药物滥用等因素，也会造成肉鸡的免疫系统受到破坏引起免疫抑制[1]。因此，如何提高肉鸡自身免疫力在养鸡生产中受到日益关注。多肽是一类由氨基酸以肽键连接在一起的化合物，聚合度小，分子大小处于蛋白质与氨基酸之间的位置。已有研究报道，多肽类制剂在提高动物生产性能、提高疫苗免疫效果、增强动物机体免疫和抗应激能力方面有良好的作用，而且不会对机体造成损害和残留[2-5]。多肽制品的研制和推广应用对促进养殖业的绿色发展，保障人类健康有着深远的意义。通常，单一的多肽氨基酸不够平衡，复合多肽则能实现不同蛋白质中氨基酸的互补。已有研究表明，复合多肽制剂能够提高肉鸡的生产性能、抗病能力及成活率[6-8]。复合胶原蛋白肽、人工合成活性肽和复合小肽等产品对肉鸡生长和免疫能力也有良好的效果[9-11]。

家禽具有哺乳动物没有的气囊，不论吸气还是呼气，家禽肺内均可进行气体交换。肉鸡通过呼吸吸入雾滴，使得多肽与鸡的眼、口、鼻、上呼吸道、肺和气囊直接接触。这种呼吸结构可扩大扩散面积，增加吸收量。禽的肺泡面积大，且含有丰富的毛细血管，使得多肽得以广泛分布并迅速被吸收。且能避免对胃肠道产生负担，多肽也不必参与肝肾代谢[12-13]。在人类治疗研究中，早已有肺部给药的先例，以避免胃酸和小肠碱性环境的干扰[14]。在实际生产中，喷雾操作比较简单、省时省力，使得喷雾给药在畜禽养殖中应用越来越广泛。本研究采用舍内喷雾的方式将复合多肽制剂用于肉鸡生产，探索其对肉鸡免疫功能的影响，为复合多肽制剂在肉鸡养殖中广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用制剂 喷雾用复合多肽制剂(细胞培养溶液经过分子筛和浓缩等技术获得的多种生物活性物质，含有多肽、氨基酸、细胞因子等多种活性成分)，天津欣普赛尔生物医药科技有限公司产品(生产批号：XLA20082801，XLB20082801)。

1.1.2 主要试剂 鸡新城疫病毒血凝抑制试验抗原、阳性血清，哈尔滨国生生物股份有限公司产品；鸡白细胞介素(interleukin，IL)4、IL-6、IL-10、补体C3(complement 3，C3)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司产品；鸡新城疫疫苗，北京信得威特科技有限公司产品。

1.1.3 试验用鸡及饲料 1日龄“科宝”肉雏鸡，北京大丰家禽有限公司产品；育雏料和育成料，天津大成饲料有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 气溶胶冷雾化弥雾机(1 L)，山东聚诚五里雾环境科技有限公司产品；BioTek 405LS洗板机、BioTek ElX800酶标仪，美国宝特公司产品；台式超速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司产品；高速台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品；电子天平，华志电子科技有限公司产品；微量移液器，美国Thermo Fisher公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

1.2.1.1 试验用动物的饲养 试验共占用4间面积及规格相同的鸡舍，鸡舍应用自动化控温设备控制鸡舍温湿度。肉鸡采用网上平养的方式，相同条件下隔离饲养，自由采食饮水，饲养期为42 d。各组试验鸡经滴鼻点眼方式免疫接种鸡新城疫活疫苗，首免日期为7日龄，二免日期为21日龄。

1.2.1.2 试验分组 选择1日龄健康科宝肉鸡120只，随机分为4组(Ⅰ组～Ⅳ组)，每组30只，每组设3个重复。Ⅰ组为低剂量组(0.05 mL/只)、Ⅱ组为中剂量组(0.1 mL/只)、Ⅲ组为高剂量组(0.15 mL/只)、Ⅳ组空白对照组。对3组试验鸡采用喷雾给药方式添加不同浓度的复合多肽制剂，空白对照组添加相同剂量生理盐水进行喷雾。

1.2.1.3 给药方法 将复合多肽制剂原液用去离子水按照一定比例进行稀释，现配现用，分别于6日龄和13日龄对各组肉鸡进行舍内喷雾。2次喷雾给药剂量按照实际体重比例进行分配，按1周龄科宝肉鸡平均体重180 g左右，2周龄科宝肉鸡平均体重500 g左右计算(数据来源北京大丰客户养殖科宝鸡实际平均体重)。6日龄受试品添加量为添加总量的25%，13日龄受试品添加量为添加总量的75%。Ⅳ组(空白对照组)采用生理盐水喷雾(表1)。

表1 复合多肽制剂工作液配制表

1.2.1.4 喷雾前关闭Ⅰ组～Ⅳ组试验鸡舍的空调及排风扇，用气溶胶冷雾化弥雾机喷雾，持续10 min，之后封闭30 min，然后打开空调和排风扇通风。喷雾的水温控制在22 ℃～25 ℃。肉鸡6日龄、13日龄各喷雾1次。

1.2.2 测定指标与方法

1.2.2.1 鸡新城疫病毒抗体效价测定 试验鸡于7、14、21、28、35、42日龄，每组各随机选择20只试验鸡翅静脉采血，测定血清中的鸡新城疫病毒HI抗体效价。

1.2.2.2 免疫器官指数测定 试验鸡于21日龄(每个组各选择5只)和42日龄(每个组各选择10只)，进行空腹称重。颈静脉放血处死，分离胸腺、脾脏和法氏囊，剔除脂肪组织，用滤纸吸干分别称重，计算免疫器官指数。

胸腺指数=胸腺重(g)/试验鸡活重(kg)；

脾脏指数=脾脏重(g)/试验鸡活重(kg)；

法氏囊指数=法氏囊重(g)/试验鸡活重(kg)。

1.2.2.3 血清中细胞因子指标测定 试验鸡于7、14、21日龄，每组各随机选择20只试验鸡翅静脉采血，室温静置30 min，3 000 r/min离心3 min，分离血清分装于200 μL EP管中，置-20 ℃保存。所有样品采集完成之后，应用ELISA测定血清中IL-4、IL-6、IL-10和C3含量。

1.2.3 统计分析 试验数据采用SPSS 2.0软件对各组试验鸡进行单因素方差分析和多重比较，试验结果用“平均数±标准差”表示。P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 复合多肽对肉鸡新城疫病毒抗体水平的影响

从表2可以看出，14、21、28日龄时，复合多肽低剂量组的肉鸡血清中新城疫病毒抗体滴度显著高于空白对照组(P<0.05)。21日龄和28日龄时，中剂量组的肉鸡血清中新城疫病毒抗体水平显著高于空白对照组(P<0.05)。结果说明舍内喷雾低剂量的复合多肽(0.05 mL/只)在14、21、28日龄对肉鸡新城疫病毒抗体水平有明显的增强作用。在35日龄和42日龄时，各组间肉鸡抗体水平无显著差异(P>0.05)。

表2 复合多肽对肉鸡新城疫病毒抗体滴度的影响

2.2 复合多肽对肉鸡免疫器官指数的影响

由表3可知，在21日龄和42日龄，与空白对照组相比，低、中、高剂量喷雾添加复合多肽对肉鸡的法氏囊系数、脾脏系数和胸腺系数都无见显著影响(P>0.05)。

表3 复合多肽对肉鸡免疫器官系数的影响

2.3 复合多肽对肉鸡细胞因子的影响

试验期肉鸡血清中细胞因子IL-4、IL-6、IL-10和C3水平测定结果见表4～表7。表4结果显示，7日龄时，低、中、高各组肉鸡血清中IL-4含量均显著高于空白对照组(P<0.05)，血清中IL-4含量随着给药剂量增加逐渐升高。14日龄和21日龄，低、中、高各组肉鸡血清中IL-4含量与空白对照组相比未见显著差异(P>0.05)，表明舍内喷雾复合多肽制剂在7日龄对肉鸡血清中IL-4含量有明显的上调作用且与给药剂量呈正相关。

表4 复合多肽对肉鸡血清中IL-4含量的影响

从表5中可以看出，7日龄和14日龄空白对照组肉鸡血清中IL-6含量均为最高，7日龄空白对照组肉鸡血清中IL-6含量显著高于低剂量组和中剂量组(P<0.05)，14日龄空白对照组肉鸡血清中IL-6含量显著高于中剂量组和高剂量组(P<0.05)。21日龄高剂量组肉鸡血清中IL-6含量最高，高剂量组肉鸡血清中IL-6含量均显著高于空白对照组和中剂量组(P<0.05)，与低剂量组相比差异不显著。结果表明，舍内喷雾复合多肽制剂对肉鸡血清中IL-6含量在7日龄和14日龄有明显下调作用。但是在21日龄这种作用不明显。

表5 复合多肽对肉鸡血清中IL-6含量的影响

从表6中可以看出，7日龄鸡群中，各剂量组IL-10与空白对照组差异不显著(P>0.05)。14日龄时，空白对照组肉鸡血清中IL-10含量最高，显著高于中剂量组和高剂量组(P<0.05)。在21日龄阶段，空白对照组肉鸡血清中IL-10含量最高，显著高于其他各试验组(P<0.05)。表明舍内喷雾复合多肽制剂对肉鸡血清中IL-10含量在14日龄和21日龄有明显下调作用。

表6 复合多肽对肉鸡血清中IL-10含量的影响

表7结果表明，7日龄各试验组肉鸡血清中补体C3含量与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。14日龄空白对照组肉鸡血清中补体C3含量最高，显著高于其他各试验组(P<0.05)。21日龄肉鸡血清中补体C3含量各组之间差异不显著(P>0.05)。结果表明，舍内喷雾复合多肽可降低14日龄肉鸡血清中补体C3含量，但对7日龄和21日龄肉鸡血清中补体C3含量没有影响。

表7 复合多肽对肉鸡血清中补体C3含量的影响

3 讨论

畜禽生产中，已有添加复合多肽、复合小肽、生物活性肽等制品来降低料重比，提高动物特异性免疫与非特异性免疫的案例。其作用机理目前尚不清楚，但作为免疫调节剂已显示出广阔的应用前景。免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。通过识别和清除异己物质、与其他系统相互协调，共同维持机体内外环境的稳定和平衡[7]。禽类的免疫系统是随着种系的发展过程逐渐形成的，负责防御有害物质对禽类机体的侵害。当机体受到抗原刺激后，免疫细胞对抗原进行识别，启动免疫细胞活化、增殖及分化。产生的效应物质将抗原排除，从而抵抗病原微生物的侵害[15]。

目前，对鸡群危害最严重的还是病毒性疾病，且尚无有效的治疗办法，最主要的手段还是采取疫苗防疫。但是各种因素导致的鸡群免疫抑制大大降低了疫苗的免疫效果。以新城疫病毒抗体滴度作为反映机体体液免疫反应水平的指标，用于复合多肽制剂对肉鸡特异性免疫能力的评估。结果显示，舍内喷雾复合多肽制剂具有改善机体免疫机能，增强疫苗免疫效果的作用。在14日龄～28日龄，以低剂量和中剂量喷雾添加复合多肽制剂都明显提高了抗体的滴度。高剂量的添加没有增强肉鸡的体液免疫反应，说明在低、中剂量喷雾添加复合多肽制剂能更好地提高机体接种疫苗后的免疫保护。但是在35日龄～42日龄，各试验组与空白对照组抗体水平差异不显著。推测是由于2次喷雾均在试验前期，时间分别为6日龄和13日龄。而多肽在体内能够被较快吸收[16]，在试验后期复合多肽通过机体的吸收、转化和代谢，其提高免疫功能作用可能有所减弱。因此，复合多肽在肉鸡体内的代谢规律有待进一步的研究，对复合多肽制剂在实际生产中的应用有一定的指导意义。

法氏囊指数、脾脏指数和胸腺指数是评价肉鸡免疫水平的重要指标，可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。一般认为免疫器官指数降低为免疫抑制所致[17]。复合多肽制剂的添加并未导致免疫器官指数降低，说明舍内喷雾复合多肽制剂不会造成机体发生免疫抑制。

复合多肽喷雾可以通过肉鸡的呼吸作用进入呼吸道，除了对肉鸡特异性免疫和免疫器官发育有影响之外，对非特异性免疫功能也可能会存在调节作用。辅助T细胞是调节体液免疫和细胞免疫的关键细胞，其功能活跃区分为辅助型T细胞1(T helper 1，Th1)和辅助型T细胞2(T helper 2，Th2)两个细胞亚群[18]。Th1细胞支持细胞介导的免疫应答，Th2细胞驱动体液免疫应答。IL-4主要由Th2细胞表达，主要调节体液免疫[19]，是评价免疫反应的重要指标。IL-6可由多种细胞合成，可激活T细胞，活化B细胞增殖分化并产生抗体，在介导免疫应答过程中有重要的作用。IL-10在机体平衡细菌、真菌、原生动物、蠕虫和病毒感染引起的炎症反应中起重要作用[20]。其活性作用开始于促炎免疫反应后，通过抑制免疫反应调控很多促炎因子的表达，并与病毒的持续性感染有关[21]。禽类的IL-10的功能与哺乳动物十分相似[22]。C3是血清中含量最高的补体成分，主要有巨噬细胞和肝脏合成，在C3转化酶的作用下，裂解成C3a和C3b两个片段，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。舍内喷雾复合多肽各剂量组在7日龄提高肉鸡血清中的IL-4含量，且呈剂量依赖性，同时下调IL-6的在血清中的蛋白表达水平。在14日龄各剂量组持续下调IL-6作用，但是到21日龄下调不再明显。14日龄和21日龄，各剂量组肉鸡血清中IL-10下调的作用最为明显。说明复合多肽制剂对肉鸡血清中IL-4、IL-6和IL-10均有良好的免疫调节作用。试验过程中7日龄和21日龄复合多肽对肉鸡血清中C3含量无显著影响，只有中间的14日龄的变化不太规律。整体来看，使用复合多肽进行舍内喷雾在提高疫苗抗体水平的同时基本不影响血清补体C3的含量。

综上所述，复合多肽制剂能够调节肉鸡的体液免疫和细胞免疫功能，其中以0.05 mL/只添加复合多肽制剂上调肉鸡新城疫病毒抗体水平效果最好。7日龄各剂量组肉鸡血清中IL-4含量显著升高且与给药剂量正相关。各剂量组14日龄和21日龄对IL-10抑制作用效果显著。