犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒多重PCR方法的建立及应用

李少晗，陈 鑫,张广智，刘维全，秦 彤*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.农业农村部兽用药物与诊断技术北京科学观测实验站，北京 100193；3.中国农业大学生物学院，北京 100193)

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)及犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是目前危害犬的2种主要病原体[1]，二者具有高度接触传播性。CDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，为单股负链不分节的RNA病毒[2]。发病犬主要临床表现为双相热、结膜炎、白细胞减少、支气管及肺炎、中枢神经系统损害等[3]。犬细小病毒为单链DNA病毒，自1967年发现至今不断发生基因突变及重组并产生多种基因型，在全球范围内广泛分布[4]。该病毒能够引起典型出血性肠炎，在犬中传染性及致病性较强。犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)，为单股正链RNA病毒[5]，存在CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ两种基因型，氨基酸序列同源性仅为50%[6]。相关研究表明，CCoV-Ⅰ与CCoV-Ⅱ常在体内以混合感染形式存在[7-9]。该病毒在犬群中具有发病率高、病死率低的特点，但幼犬感染后病死率较高。临床腹泻病例中常发生CPV与CCoV混合感染，同时，CDV感染犬时会引起全身性的免疫抑制现象[10-11]。犬只在发生3种病毒混合感染时的存活率较低。由于临床治疗手段有限，目前针对该类疾病主要以疫苗免疫预防为主。因此在疾病早期及时的诊断干预，将大大降低动物的病死率。

普通PCR/RT-PCR具有灵敏性高、特异性强的优点，但该类方法操作复杂，耗时长，成本高，因此，在临床检测应用中，快速、高效的多重PCR正在不断普及。在本研究中，成功建立了一种同时检测CDV、CPV、CCoV-Ⅰ 及 CCoV-Ⅱ 的多重PCR方法，可为今后临床样品的快速鉴别检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒株 CPV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CPIV、CAV 毒株及大肠埃希氏菌、沙门氏菌、多形拟杆菌菌株，均由本实验室保存及鉴定。CDV毒株由中国农业大学惠赠。

1.1.2 主要试剂 LATaqDNA 聚合酶、2×Prime STAR Max DNA Polymerase、DNA标准DL 1 000、pMD19T-Vector，宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA/RNA核酸提取试剂盒，艾德莱生物公司产品；RNA反转录试剂盒，南京诺唯赞生物公司产品；胶回收试剂盒及EasyPure®Plasmid MiniPrep Kit，OMEGA公司产品；DH5α 感受态细胞，北京全式金生物科技公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 电泳仪、PCR仪，Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统，Tanon公司产品；细菌培养箱，上海一恒生物科技有限公司产品；Nanodrop分光光度计，Life Real公司产品；细菌超净工作台，北京亚泰科隆实验科技开发中心产品；小型台式离心机，Thermo公司产品；SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank中CDV的H基因序列，CPV的VP2基因序列及CCoV参考文献[12]设计合成4对特异性引物(表1)，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 多重PCR扩增引物序列

1.2.2 标准质粒模板的构建 对CPV的DNA，CDV、CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的cDNA进行PCR扩增。反应体系为：LATaq酶 0.5 μL，10×buffer 5 μL,dNTP Mix 8 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL/cDNA 3 μL，ddH2O补足至50 μL。扩增条件为：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 延伸 10 min。PCR产物胶回收后，分别与pMD19-T Vector 16 ℃连接30 min，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，菌液PCR鉴定得到阳性单菌落后，送至北京擎科生物公司进行测序，测序成功的质粒作为标准质粒模板。

1.2.3 多重PCR的建立 分别以相同浓度的重组质粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ、pMD-CCoV-Ⅱ 为模板，设置退火温度为48.0 ℃～62.5 ℃，进行温度梯度PCR。采用25 μL反应体系：2×Prime STAR Max 12.5 μL，CDV、CPV及CCoV-Ⅰ上、下游引物各0.5 μL，CCoV-Ⅱ上、下游引物各1.0 μL，重组质粒pMD-CPV，pMD-CDV，pMD-CCoV-Ⅰ 各0.5 μL，重组质粒pMD-CCoV-Ⅱ 1.0 μL，ddH2O补足至25 μL。扩增条件为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，48.0 ℃～62.5 ℃ 10 s(设置15个梯度)，72 ℃ 10 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 多重PCR的特异性试验 利用优化后的多重PCR，对3种主要肠道病原菌大肠埃希氏菌、沙门氏菌和多形拟杆菌，以及CPV、CDV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CPIV、CAV及CPV+CDV+CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ 的DNA/cDNA进行扩增，来检测该方法的特异性。

1.2.5 多重PCR的敏感性试验 使用Nanodrop 2000分光光度计，测定重组质粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ和pMD-CCoV-Ⅱ 的浓度，将该浓度按照拷贝数公式进行换算。拷贝数(copies/μL)=质粒浓度(g/μL)×6.02×1023/(660×质粒长度bp)。将各重组质粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ和pMD-CCoV-Ⅱ均稀释至1×1010copies/μL，并进行10倍梯度稀释至1×101copies/μL，用于检测多重PCR的敏感性，并与单项PCR敏感性进行比较。

1.2.6 多重PCR的重复性 在对多重PCR的重复性检测中，选择3个不同稀释度质粒模板1×108copies/μL、1×107copies/μL和1×106copies/μL，在不同时间点、不同PCR扩增仪中进行3次重复试验，用于检测该多重PCR方法的重复稳定性。

1.2.7 多重PCR的初步应用 用建立的多重PCR方法对2020年-2021年由北京、河北等地区宠物医院采集的50份临床腹泻病料进行检测，同时与单项PCR检测结果进行比较。

2 结果

2.1 标准质粒模板的构建

对CPV、CDV、CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的DNA/cDNA进行PCR扩增，PCR产物胶回收后连接至pMD19-T Vector，各重组菌液PCR扩增片段分别为573、410、289、105 bp，片段大小与预期相符(图1)，菌液送至北京擎科生物公司测序比对结果正确。

M.DNA标准DL 1 000; 1.CPV目的基因; 2.CPV阴性对照; 3.CDV目的基因; 4.CDV阴性对照; 5.CCoV-Ⅰ目的基因; 6.CCoV-Ⅰ阴性对照; 7.CCoV-Ⅱ目的基因; 8.CCoV-Ⅱ阴性对照

2.2 多重PCR的建立

利用确定好的反应体系，以重组质粒pMD-CPV、pMD-CDV、pMD-CCoV-Ⅰ和pMD-CCoV-Ⅱ为模板，进行多重PCR扩增反应。经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，同时获得573、410、289、105 bp目的片段，与预期大小相符。经退火温度条件的优化，最终选择50.7 ℃作为该方法的最佳退火温度(图2)。

M.DNA标准DL 1 000;1.阴性对照; 2～16.分别为48、48.5、49.3、50.7、52.3、53.6、54.5、55、56、56.5、57.4、58.7、60.3、61.6、62.5℃

2.3 多重PCR的特异性试验

采用建立的多重PCR对大肠埃希氏菌、沙门氏菌、多形拟杆菌、CPV、CDV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ、CPIV、CAV及CPV+CDV+ CCoV-Ⅰ+ CCoV-Ⅱ 进行检测，发现仅CPV、CDV、CCoV-Ⅰ、CCoV-Ⅱ 及CPV+CDV+ CCoV-Ⅰ+ CCoV-Ⅱ 有特异性条带，而大肠埃希氏菌、沙门氏菌、多形拟杆菌、CPIV及CAV未出现扩增条带(图3)。结果表明，该方法具有良好的特异性。

M.DNA标准DL 1 000;1.阴性对照; 2.大肠埃希氏菌；3.沙门氏菌；4.多形拟杆菌；5.CPIV; 6.CAV; 7.CCoV-Ⅱ; 8.CCoV-Ⅰ; 9.CDV; 10.CPV;11.CPV+CDV+ CCoV-Ⅰ+ CCoV-Ⅱ

2.4 多重PCR的敏感性试验

将初始浓度为1×1010copies/μL的重组质粒10倍稀释至1×101copies/μL，取各个稀释度的重组质粒模板进行多重PCR和单项PCR。结果表明，多重PCR可以检测到CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的最低拷贝数分别为1×107copies/μL、1×103copies/μL、1×106copies/μL和1×104copies/μL。而单项PCR的最低拷贝数分别为1×107copies/μL、1×102copies/μL、1×104copies/μL和1×104copies/μL。对于CPV及CCoV-Ⅱ多重PCR与单项PCR的敏感性一致，而针对CDV及CCoV-Ⅰ多重PCR敏感性略逊于单项PCR，但差异不大(图4)。

M.DNA标准DL 1 000;1.阴性对照；2～11.pMD-CPV质粒浓度由1×1010～1×101 copies/μL、pMD-CDV质粒浓度由1×1010～1×101 copies/μL、pMD-CCoV-Ⅰ质粒浓度由1×1010～1×101 copies/μL和pMD-CCoV-Ⅱ质粒浓度由1×1010～1×101 copies/μL

2.5 多重PCR的重复性

采用建立的多重PCR，对1×108copies/μL、1×107copies/μL和1×106copies/μL 3个不同稀释度质粒模板，在不同时间，使用3个不同的PCR扩增仪进行检测，结果表明，不同条件下的扩增结果相似，证明该方法具有良好的重复稳定性(图5)。

M.DNA标准DL 1 000;1～3.1×108 copies/μL、1×107 copies/μL和1×106 copies/μL稀释度质粒模板第一次扩增；4～6.1×108 copies/μL、1×107 copies/μL和1×106 copies/μL稀释度质粒模板第二次扩增；7～9.1×108 copies/μL、1×107 copies/μL和1×106 copies/μL稀释度质粒模板第三次扩增

2.6 多重PCR的初步应用

对2020年-2021年由北京、河北等地区宠物医院采集的50份临床腹泻病料进行多重PCR检测，结果表明，CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的阳性率分别为32%(16/50)、24%(12/50)、18%(9/50)、10%(5/50)。双重感染类型CPV+CCoV-Ⅰ阳性率为2%(1/50)，CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ阳性率为8%(4/50)。三重感染类型CDV+CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ阳性率为2%(1/50)。

同时对50个病料进行了常规单项PCR检测，比较结果发现，CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的阳性率分别为30%(15/50)、24%(12/50)、18%(9/50)、16%(8/50)，单项PCR未检测出CPV+CCoV-Ⅰ混合感染病例；CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ阳性率为12%(6/50)；CDV+CCoV-Ⅰ+CCoV-Ⅱ 的结果与多重PCR一致(表2)。

表2 多重PCR及单项PCR临床样品检测结果

3 讨论

近年来在对宠物医院临床犬病例的流行病学调查中发现，多种病原混合感染的现象普遍存在[13]。常规PCR具有检测灵敏性高、特异性强的优点，但是发生多种病毒混合感染时，存在操作流程繁琐、耗时长、成本高的缺点[14]。本研究成功建立了同时检测CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的多重PCR，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的特点，大大缩短了检测周期，避免了试剂耗材的浪费及大量实验操作过程中存在的交叉污染现象。本试验中使用的高保真快速DNA聚合酶预混液，只需在体系中添加酶、ddH2O、预混合引物及模板即可完成快速高效扩增，使得检测过程更加简便，同时降低了操作污染的风险。

引物设计是多重PCR建立过程中的首要关键步骤，引物需要设计在序列保守区域内[15]，避免非特异性扩增，具有相似的退火温度，避免引物二聚体及发夹结构[16]。本研究中针对CPV的VP2基因、CDV的H基因、CCoV的M基因保守序列设计并合成了4对引物，试验结果表明，各引物间无相互干扰、特异性强、各个模板扩增片段大小合适，易于区分，分别为573 bp、410 bp、289 bp和105 bp。多重PCR反应体系并非单项PCR各反应体系的叠加，需要对模板浓度、引物比例、退火温度及延伸时间等条件进行摸索[17-18]。本研究中适当提高了CCoV-Ⅱ的模板及引物浓度，并确定了50.7 ℃为最佳退火温度。本研究建立的多重PCR对CPV及CCoV-Ⅱ的灵敏度与普通PCR一致，而CDV及CCoV-Ⅰ的灵敏性略差于普通PCR，原因可能是在多个模板及多对引物存在的PCR反应体系中，PCR扩增反应存在竞争不平衡的现象，很难保证针对每一种模板的敏感性达到最优，但该方法在实际应用中能够较好的满足检测需求。在对50份临床病料检测过程中发现，该多重PCR能够较好的完成单一病原及多重病原混合感染的检测，结果与单项PCR结果大致相同，且对混合感染病例的检测更加高效便捷，值得后期推广应用。同时在检测过程中也发现了一些限制性因素，由于采集病料中的CCoV-Ⅱ病毒粒子含量较低，多重PCR反应体系中的各个混合引物组分可能会优先扩增较高浓度模板，从而降低对CCoV-Ⅱ的检出率，使得该多重PCR针对CCoV-Ⅱ的阳性检出率略低于常规单项PCR。后续还需不断提高临床检测的样本量，来更全面的评价该方法，同时也需要不断深入研究并对此方法进一步提升优化。

CPV及CDV目前仍是世界范围内犬科动物主要感染的两大病原体。CPV的遗传进化速度非常快，已报道发现有CPV-2/2a/2b/2c及new CPV-2a/2b 6种基因型[4,19-20]，本研究设计的CPV引物能够扩增不同基因型毒株。CDV常与其他病原体共同感染，有报道指出CDV的感染宿主范围不断扩大，已有恒河猴感染的报道，这也使得CDV感染人成为可能[21]。CCoV有CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ两种基因型，由于该病毒难以分离培养，目前关于此类病毒的研究及报道较少[22-24]。Pratelli A等[25]发现在CCoV-Ⅱ 跨膜区和羧基末端，只有少数分散的替换，而CCoV-Ⅰ的M蛋白中发生许多类似于猫冠状病毒典型残基的替换，基于此可以区分Ⅰ型和Ⅱ型。在对采集的临床样本进行检测后发现CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ的混合感染普遍存在。随着新冠疫情的暴发流行，人们对于犬、猫冠状病毒的关注度也在不断提高，因此，做好对宠物疫病的监控，也是对人类健康的保护。

本研究为CPV、CDV、CCoV-Ⅰ及CCoV-Ⅱ的检测提供了一种高效、灵敏、特异、高通量、低成本的检测方法，可为今后的实验室诊断、病原学研究、宠物重要疫病流行监控及流行病学调查提供帮助。