放疗诱导肿瘤细胞铁死亡的研究进展及治疗策略

魏士杰，刘 赛，朱海涛综述，高 洁审校

0 引 言

铁死亡是近年来发现的由铁离子过量、活性氧增多导致脂质过氧化物堆积的一种新型调节性细胞死亡(regulated cell death, RCD)，其形态和机制与凋亡、自噬和坏死等其他类型的RCD不同。形态学上，铁死亡的细胞多表现为线粒体膜密度升高，线粒体嵴缩短[1-4]。最近的研究已经证实：诱导肿瘤细胞铁死亡是一种很有前景的肿瘤治疗策略。

放疗是依赖于电离辐射来根除肿瘤细胞的一线治疗方式[5]。高能X射线通过引起直接和间接途径导致DNA结构破坏、DNA单链破裂和DNA双链断裂达到肿瘤杀伤效果[6]。另外，高能射线产生高活性的OH·自由基、过氧化物可以引起核酸、脂质和蛋白质损伤[7-8]。然而，肿瘤细胞固有的放疗抵抗特性显著削弱放疗的临床肿瘤治疗效果[9]。

最近的研究发现：放疗除了能够促进肿瘤细胞凋亡，还可以诱导肿瘤细胞铁死亡，在清除难治性肿瘤细胞中发挥重要作用[10-11]。本文综述放疗对肿瘤细胞生物学行为，尤其是铁死亡的作用及其机制；铁死亡与其他放疗诱导的RCDs之间的关联。最后讨论基于铁死亡的肿瘤联合治疗策略。

1 放疗对肿瘤细胞生物学效应及其机制

放疗诱导的DNA损伤应答主要通过激活下游检查点分子激酶1/2，并磷酸化p53，进而引起细胞周期阻滞及DNA损伤修复。DNA损伤有效修复，则进入正常细胞周期；否则会引发细胞有丝分裂突变、衰老、凋亡或其他形式的RCD[12]。研究发现：放疗依赖于共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia-mutated gene, ATM)、 AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase)、沉默调节蛋白和线粒体活性氧等途径促进肿瘤细胞自噬。自噬具有促进放疗后肿瘤细胞生存或死亡的双重效应，且这一作用呈环境依赖性[13]。除此之外，放疗可以诱导肿瘤细胞和正常组织发生非经典途径的坏死[14]。

2 肿瘤细胞铁死亡的分子机制

铁死亡是过量游离二价铁离子与过氧化物发生芬顿反应形成氧自由基，进而攻击膜性结构的多不饱和脂肪酸，导致过量的脂质过氧化物积累而引起的死亡[15]。研究显示：多条途径参与肿瘤细胞铁死亡的调控，如谷胱甘肽过氧化物酶4 (Glutathione Peroxidase 4, GPX4)依赖和非依赖系统、多不饱和脂肪酸合成及氧化和铁代谢[16]。

2.1SLC7A11-GPX4轴依赖系统溶质载体家族七成员11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)是Xc-系统的核心成份，调节胱氨酸的输入和谷氨酸的转出。进入细胞内的胱氨酸在细胞质中被还原成半胱氨酸，进而合成谷胱甘肽(glutathione, GSH)。GSH是GPX4消除脂质过氧化物的重要辅助因子。GPX4主要是将毒性类脂过氧化物还原成无毒的脂质醇，维持细胞膜的完整性和铁死亡抵抗[14]。因此，GPX4为铁死亡抵抗途径的核心。目前，针对Xc-系统和GPX4的特异性抑制剂(erastin，RSL3)是经典的铁死亡诱导剂[17]。部分肿瘤细胞的化疗抵抗机制主要依赖于GPX4，这也为难治性肿瘤治疗提供潜在靶点。

2.2非SLC7A11-GPX4轴依赖系统NAD(P)H-FSP1-CoQ近年报道的铁死亡抵抗新机制[18]。铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein, FSP1)通过消耗还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NAD(P)H)将辅酶Q (ubiquinone, CoQ)还原成还原性辅酶Q(CoQH2)，CoQH2捕获亲脂性自由基抑制铁死亡。研究显示：二氢乳清酸脱氢酶与线粒体GPX4(非细胞质GPX4或FSP1)将泛素酮还原成泛素醇，可有效控制线粒体内膜脂质过氧化导致的铁死亡[19]。此外，复合体III依赖的膜修复通路也参与肿瘤细胞铁死亡抵抗[20]。以上研究结果表明：肿瘤细胞存在多种铁死亡抵抗途径。

2.3脂肪酸氧化疏水性的多不饱和脂肪酸在酰基辅酶A合成化酶长链家族成员4(Acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4)和溶血性磷脂酰转化酶3催化下，合成脂质过氧化物，过量的脂质过氧化物可导致铁死亡[21]。脂氧酶(arachidonate lipoxygenase, ALOXs)细胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidoreductase, POR)均参与了多不饱和脂肪酸的氧化。除此之外，含多不饱和脂肪酸的醚类可作为脂质过氧化的替代底物，参与肿瘤细胞铁死亡的发生[22]。最近研究提示：硬脂酰辅酶A去饱和酶和酰基辅酶A合成酶长链家族成员3可以通过抑制多不饱和脂肪酸的合成，阻止脂质过氧化物的聚集，进而抑制肿瘤的铁死亡[23]。

2.4铁代谢游离二价铁(Fe2+)与过氧化物通过芬顿反应，产生大量自由基，导致脂质过氧化。三价铁离子(Fe3+)主要依靠转铁蛋白受体1运入细胞，进而储存在铁蛋白因此，铁蛋白的丰度，特别是铁蛋白重链，对抑制铁死亡至关重要[24-25]。铁自噬可以促铁蛋白中的铁释放到胞内铁池中，增加肿瘤细胞对铁死亡诱导剂的敏感性[26]。此外，Fe2+是ALOXs、POR等脂质过氧化酶的辅助因子。脂质过氧化酶中Fe2+的释放会进一步加速脂质过氧化物的累积，导致广泛的铁死亡[27]。

3 放疗和铁死亡

越来越多的研究证实：放疗具有诱导肿瘤细胞铁死亡的效应，且其潜在机制正逐渐被阐明。

3.1放疗诱导肿瘤细胞铁死亡及机制大量证据表明：在肺癌、乳腺癌、小纤维肉瘤和黑色素瘤等实体瘤中，放疗可增加细胞内脂自由基，丙二醛，环加氧酶2表达水平。形态学上，放疗可以诱导肿瘤线粒体萎缩，膜密度显著提高等铁死亡表现。铁死亡抑制剂(ferrostatin-1和liproxstatin-1)及铁螯合剂去铁胺可逆转放疗对肿瘤细胞克隆形成能力的抑制效果。放疗诱导的肿瘤细胞铁死亡呈剂量和次数依赖性。与多次低剂量照射(如3×5Gy)相比，单次大剂量照射(如10Gy)可有效诱导肿瘤细胞铁死亡[14]。放疗诱导肿瘤细胞铁死亡主要依赖于以下机制：首先，放疗诱导肿瘤细胞产生脂质过氧自由基，通过芬顿反应从其他分子中获取H·，最终产生脂质过氧化物；其次，放疗促进肿瘤细胞ACSL4表达，进而促进脂质过氧化物合成；另外，放疗具有耗竭GSH，削弱GPX4表达的效能，进而导致肿瘤细胞氧化还原稳态失衡，导致细胞铁死亡[28]。除此之外，放疗对SLC7A11的表达具有双重效应，且呈肿瘤细胞系异质性和放疗剂量依赖性。

3.2其他潜在机制p53是放疗的核心效应因子。近期研究发现：p53在肿瘤细胞铁死亡中也发挥双重作用。一方面，p53可以降低SLC7A11基因调控区域上的组蛋白H2B单泛素化水平，导致SLC7A11蛋白水平降解，促进铁死亡。另一方面，p53可以维持GSH水平，或抑制二肽基肽酶-4的活性，进而抑制铁死亡[29]。因此，p53在放疗肿瘤细胞铁死亡中的确切作用仍值得进一步探究。

AMPK是参与放疗铁死亡敏感性的另一个潜在机制。AMPK对肿瘤细胞铁死亡敏感性具有环境依赖性：生理水平，磷酸化的AMPK可抑制Xc-系统活性，促进铁死亡[30]；能量应激情况下，磷酸化的AMPK可抑制脂质过氧化物，进而抑制铁死亡。因此，放疗可以激活AMPK，而AMPK在放疗诱导铁死亡中的确切作用还有待研究。

3.3放疗诱导铁死亡的免疫效应放疗诱导的肿瘤细胞死亡具有免疫原性，又称之为免疫原性死亡。近期研究表明：放疗诱导的肿瘤细胞铁死亡亦具有免疫原性[31]，且这一效应具有时间依赖性，即肿瘤细胞铁死亡早期阶段(1 h内)比晚期阶段(24 h后)具有更强的免疫原性。肿瘤细胞铁死亡早期阶段释放大量的损伤相关分子模式，如腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)和高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein, HMGB1)，促进骨髓源性树突状细胞成熟，进而有效地促进免疫系统活性；而晚期阶段的铁死亡的细胞由于ATP和HMGB1释放耗尽，其免疫原性效应显著降低[32]。Lang等[10]研究表明：放疗通过激活ATM信号通路，抑制SLC7A11蛋白表达，减少肿瘤细胞内胱氨酸摄取，进而抑制GPX4蛋白生成，增强脂质过氧化，促进肿瘤细胞铁死亡，增敏免疫治疗。因此，鉴于放疗诱导肿瘤细胞铁死亡的免疫原性，联合放疗和免疫治疗对于难治性肿瘤具有广阔的临床前景。

4 基于铁死亡的放疗联合增敏策略

铁死亡诱导剂(ferroptosis inducers，FINs)分为I类(SLC7A11抑制剂，如erastin和柳氮磺胺吡啶)，II类(GPX4抑制剂，RSL3和ML162)和III类(CoQ和GPX4耗竭剂，FIN56)。研究证实：I类FINs (erastin)联合放疗具有显著的抑瘤效应，还可降低放疗的不良反应[33]；柳氮磺胺吡啶可有效增敏放疗对卵巢癌和肺癌异种移植模型的抑制效应，促进肿瘤组织铁死亡[34-35]。抑制GSH合成或靶向抑制GPX4是放疗增敏的另一新型策略，尤其适用于放疗抵抗的难治性肿瘤。研究显示：FIN56可以增敏放疗对非小细胞肺癌细胞的杀伤效应。除此之外，SLC7A11和GPX4被认为是放疗和铁死亡诱导剂联合治疗的生物标志物。

放疗具有免疫佐剂的效能，被认为是增敏免疫治疗的最佳手段[36]。然而，基于临床大队列研究发现：放疗与免疫治疗联合使用，特别是免疫检查点抑制剂，并未有效改善肿瘤患者预后和总生存期[37]，免疫学检查点控制剂联合放疗可有效促进肿瘤细胞铁死亡,而这一效应与SLC7A11表达水平呈负相关。研究显示：SLC7A11的表达水平与CD8+T细胞数量、干扰素γ分泌水平以及肿瘤患者的预后呈负相关。因此，基于诱导铁死亡的免疫治疗和放疗联合治疗手段具有广阔的临床应用前景。

5 结论与展望

放疗是临床肿瘤治疗的一线手段。然而，肿瘤异质性显著降低了放疗对肿瘤的抑制效应。鉴于铁死亡在难治性肿瘤中的临床价值，深入研究放疗诱导铁死亡的确切作用及机制，筛选特异性生物标志物，可以让更多的肿瘤患者人群受益。除此之外，铁死亡诱导剂与放疗联合治疗不可避免的不良反应，是限制其进一步临床推广应用的瓶颈。基于纳米技术的靶向递送系统和增敏策略，可以有效解决这一困境。