循环肿瘤DNA在消化系统肿瘤中的应用进展

许 晶综述，金顺花审校

0 引 言

在中国最常见的十种恶性肿瘤中，消化系统占一半，且部分肿瘤的发病率逐年上升[1]。在以“精准医疗”为主题的诊疗背景下，如何实现个体化、精准、有效治疗是现在和未来消化系统肿瘤患者治疗的发展研究方向。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)可作为一种潜在的肿瘤标记物[2]，其检测方式具有无创性、可重复性，可以为肿瘤的早期筛查、疗效的实时监测、预测复发转移及判断预后提供重要信息。本文主要就ctDNA及其在消化系统肿瘤中的应用进展进行阐述。

1 ctDNA概述

1948年，MandEL和METAIS第1次在血液中发现细胞外的循环游离 DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)[3]。ctDNA是一种循环中的cfDNA，是通过肿瘤细胞坏死、凋亡等方式释放到体液中的。ctDNA在外周血等体液中有多种存在形式(包括单链、双链、蛋白质复合体等)[4-5]。ctDNA具有与肿瘤组织相同的基因变异信息，如突变、拷贝数异常和过度甲基化等[6]。ctDNA片段的大小波动很大，约70～21 000 bp[7]，半衰期从数分钟到数小时不等。同时，ctDNA含量和肿瘤组织类型、部位、负荷等具有相关性。根据上述ctDNA的特点，将其应用于肿瘤发展过程的检测中，为消化系统肿瘤的诊治提供新的手段。

2 ctDNA的检测方法

目前ctDNA 的检测手段很多，各有其优缺点和适用的检测范围。检测技术通过对ctDNA进行定量或定性，来获得原发肿瘤的基因缺陷信息。目前常用的检测方法有数字聚合酶链式反应、下一代测序技术两种。

2.1数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction, dPCR)dPCR作为一种定量检测技术，可以直接算出核酸分子的数目。dPCR定量的原理是通过稀释样本，使其进行独立的PCR反应，然后再独立扩增来计算出目标分子序列的浓度[8]。肿瘤学中最常用dPCR技术有3种，包括微滴式数字PCR(droplet digital dolymerase chain reaction ，ddPCR)、基于芯片的dPCR、BEAMing 技术。目前ddPCR是检测KRAS突变的一种准确、简便的ctDNA定量技术。Earl等[9]应用ddPCR技术发现KRAS突变与胰腺癌患者生存期显著相关。Cheng等[10]利用ddPCR在胰腺癌患者中检测的KRAS的突变率为72.3%。与其他dPCR方法相比[11]，ddPCR不需要使用稀释的样品，也不需要与复杂的微流体系统进行分配是其优点之一。基于芯片的dPCR主要优点是由于没有乳化PCR，既降低了成本，也降低了污染和样品丢失的风险，与其他dPCR相比，价格最低。BEAMing的优势是灵敏度高，但其流程操作复杂，价格也因检测成本增加而升高。

2.2下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)NGS作为一种高自动化的测序技术，可以同时对几百万条DNA分子进行分析，极大地降低了测序时间和成本。下一代测序提供了一种在更广阔的目标空间中筛选突变的方法。NGS首先利用PCR扩增位点，然后对扩增子内的整个区域进行测序，从而可以检测出目标空间内的任何变异。NGS技术在消化系统肿瘤中的应用具有广阔的前景。JIN等[12]利用基因NGS测试来评估46名接受免疫治疗的进展期胃癌患者的治疗效果。Tarazona等[13]应用NGS追踪结肠癌的微小残留病变，进而确定结肠癌复发的高危患者。Rachiglio等[14]用NGS技术分析转移性结直肠癌的ctDNA的RAS突变，敏感性为100%。NGS适用于血浆样本的检测，但同时NGS的敏感性也会受到原发肿瘤的存在和异质性的影响。NGS可应用于肿瘤的筛查、早期诊断、疗效评估、预测复发转移及预后等。目前关于ctDNA的检测与分析尚未有公认的参考标准。希望通过未来更大样本数据的积累，为ctDNA检测标准指南的出台做出贡献。

3 ctDNA在消化系统肿瘤中的临床应用进展

3.1 ctDNA与肿瘤筛查及早期诊断采用精准有效的检测技术实现早诊早治，可改善早期消化系统肿瘤患者预后。多项研究表明，肿瘤患者和健康者血浆中ctDNA水平存在差异。在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌患者血浆中的ctDNA含量高于健康者[15-17]。消化系统肿瘤的早期即可出现许多基因改变(如基因突变、杂合性缺失和基因过度甲基化等)。原癌基因 KRAS 突变是消化系统肿瘤的早期事件之一。在结直肠癌患者的血浆ctDNA中可检测到KRAS突变，其突变状态与肿瘤组织具有较高的一致性[18]。Almoguera等[19]发现，ctDNA可以检测到胰腺癌KRAS基因的密码子12点突变。在胰腺癌中，ctDNA和肿瘤组织中KRAS突变的符合率约为54%～91%[20]。ctDNA与糖类抗原19-9、癌胚抗原carcinoembryonic antigen,CEA)等联合检测早期胰腺癌，其灵敏度为64.0%，特异度为99.5%[21]。胰腺癌的发生有一个较长的亚临床期，通过临床表现和实验室检查很难早期诊断，但可以通过对胰腺癌患者外周血ctDNA的突变基因进行检测，实现对胰腺癌的早期筛查。DNA甲基化等表观遗传变化是癌症发生的早期特点。ctDNA异常甲基化检测可应用于消化系统肿瘤的早期筛查和早期诊断。有数据表明，对于早期结直肠癌的诊断，ctDNA的SEPT9 异常甲基化显示出比传统肿瘤标志物更好的敏感性[22]。Lu等[23]研究结果表明，血浆ctDNA中RASSF1A、COX2和APC基因的高甲基化可用于鉴别甲胎蛋白 <20 ng/mL的肝细胞癌患者。

ctDNA在消化系统肿瘤的早期筛查与诊断中表现出巨大的潜力，未来我们可能在肿瘤产生临床症状与影像学表现出现之前，就可以提前对消化系统肿瘤高危人群进行普及筛查，对ctDNA 阳性患者早期防治，提高患者的生存率。

3.2ctDNA与治疗疗效评估针对不适合手术的晚期肿瘤患者，当前的治疗方案是以综合治疗为主，包含新辅助化疗、靶向药物治疗和免疫治疗等。ctDNA保留了肿瘤基因组信息，半衰期较短，可以动态监测，实时判断药物疗效及耐药情况，指导临床医师及时调整、制定精准有效的治疗方案。

3.2.1ctDNA与新辅助化疗新辅助化疗能在术前有效缩小肿瘤或转移灶，已被研究证明能成功提高胃癌、结肠癌的总体生存率[24]，是晚期消化系统肿瘤的主要治疗策略。新辅助化疗需要及时监测治疗反应，为患者选择最佳的手术时机及调整化疗周期。近年ctDNA检测技术的发展日新月异，可检测出微小残留病灶[25]，且早于CEA水平上升和影像学诊断，根本上改变了对新辅助化疗疗效的评估方式[26]。研究发现，ctDNA水平与新辅助治疗前后的肿瘤负荷密切相关[27]。接受新辅助治疗后，ctDNA水平持续升高的2名直肠癌患者，均发生了肿瘤复发；Tie等[28]发现新辅助治疗后的ctDNA水平可作为预测直肠癌复发的生物学标志物。FOLFIRINOX(奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶、亚叶酸钙)为胰腺癌一线新辅助化疗方案。Wei等[29]发现38名接受FOLFIRINOX化疗的晚期胰腺癌患者的ctDNA与肿瘤负荷相关，监测ctDNA可评估新辅助化疗效果，指导新辅助化疗的个体化治疗，减少过度的化疗和经济负担。

3.2.2ctDNA与靶向药物治疗靶向治疗需要首先对肿瘤进行基因检测，确定靶向药物的靶点。靶向治疗依赖于敏感基因和耐药基因的检测。目前，胃癌靶向治疗中主要药物靶点是人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，曲妥珠单抗是抗HER2的单克隆抗体，目前尚无预测疗效及耐药标志物。Wang等[30]研究发现，56例应用曲妥珠单抗治疗的进展期胃癌患者的ctDNA和肿瘤组织中HER2扩增具有高度一致性，表明ctDNA可作为评估曲妥珠单抗靶向治疗疗效的标志物。HER2扩增是结肠癌的一种新兴生物标志物。Siravegna等[31]研究表明，ctDNA的HER2拷贝数高的结肠癌患者对HER2靶向治疗反应更好，可用于筛选HER2靶向治疗适合人群。

靶向治疗的大部分患者产生耐药性[32]，通过实时监测外周血 ctDNA 的基因变化，有助于及早地发现耐药性。研究显示，通过肿瘤组织的基因改变评估耐药具有局限性，ctDNA与肿瘤组织有相似的基因谱，可替代活检分析肿瘤耐药机制[33]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)扩增在结直肠癌中最为常见[34]，西妥昔单抗和帕尼图单抗(EGFR的单克隆抗体)是结直肠癌患者常用的靶向药物。大部分患者对EGFR靶向治疗反应短暂，持续时间不超过12～18个月，提示肿瘤细胞对药物产生了耐药性[35]。研究表明EGFR抗体的耐药性与RAS突变有关。Cao等[36]利用ctDNA对152例晚期结肠癌患者进行了治疗靶点的研究，结果共确定56例患者(36.84%)的90个药物敏感基因，揭示了抗EGFR抗体的各种耐药机制。英菲格拉替尼是成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor recepter，FGFR)抑制剂。文献报道，对接受英菲格拉替尼治疗的3名晚期肝内胆管癌患者进行ctDNA分析，发现FGFR2基因新的点突变与英菲格拉替尼的耐药性有关[37]。肿瘤靶向药物的耐药是临床上亟待解决的问题，利用ctDNA揭示肿瘤靶向药物的耐药分子机制，寻找新的药物靶点，及时发现耐药产生，指导患者用药，使患者临床获益更大，并将促进精准医疗的发展。

3.2.3ctDNA与免疫治疗免疫治疗作为一种新兴的肿瘤治疗策略，目前尚未广泛应用于消化系统肿瘤治疗。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)可以阻断免疫检查点[如程序性死亡因子-1(programmed death 1,PD-1) ]，恢复T细胞活化，使其发挥抗肿瘤作用[38]。利用ctDNA可以评估消化系统肿瘤患者ICIs治疗后的预后[39]。目前，抗PD-1已被批准应用于转移性黑色素瘤等肿瘤中[40]，对接受ICIs的转移性黑色素瘤患者，进行BRAF或NRAS突变定量可以监测肿瘤的耐药性。这对探索ctDNA在刚崭露头角的消化系统肿瘤免疫治疗有非常大的参考和借鉴价值。Khagi等[41]检测69例接受ICIs治疗后的恶性肿瘤患者(其中6例为消化系统肿瘤患者)血浆ctDNA,结果表明，ctDNA突变>3个意义不明确的突变患者接受ICIs治疗后，生存期延长。研究显示，ICIs治疗前ctDNA基线水平低的患者较ctDNA基线水平高的患者，疗效好，无进展生存期长[42]。假进展给临床医师评估免疫检查点阻断疗效带来新的挑战。假进展是指原发肿瘤的大小先增加或出现新的病变[43-44]，随后肿瘤缩小。Guibert等[45]对2例KRAS突变的胰腺癌患者进行ctDNA分析，结果表明，ctDNA低水平与免疫治疗的假进展相关，ctDNA高水平与真进展有关。我们可以通过ctDNA水平或基因突变检测，判断消化系统肿瘤免疫治疗效果，避免因采样困难、肿瘤假性进展对免疫治疗方案疗效产生误判。

3.3ctDNA与复发转移及预后评估消化系统肿瘤的复发和转移是患者死亡的主要原因，与临床发现不及时有关。因此评估复发转移与预后，对于提高患者生存期意义重大。实时监测ctDNA水平及基因变化，可评估肿瘤的复发转移及术后患者的残余病灶，其具有潜在的临床应用价值。ctDNA是一种评估肿瘤负荷更直接、简便的生物标志物。与CT成像相比，提前2～15个月发现肿瘤复发[46]。越来越多的证据表明，ctDNA与消化系统肿瘤的预后有关。Pietrasz等[47]对135例胰腺癌患者的ctDNA进行分析，结果表明ctDNA是判断晚期胰腺癌预后的独立指标。Lee等[48-49]发现ctDNA预测术后胰腺癌患者复发的敏感性为90%，特异性为88%。Fang等[50]纳入2326名胰腺癌患者荟萃表明分析，ctDNA是胰腺癌患者的总生存率和无进展生存率的重要预测因子。研究表明，利用ctDNA检测可预测胃癌、结肠癌术后复发风险[51-52]。Watanabe 等[53]研究发现，术后1年内未检测出 ctDNA的KRAS突变患者，预后明显改善，提示ctDNA的KRAS突变与胰腺癌的预后密切相关。

4 ctDNA检测的优势及局限性

ctDNA检测以其无创、简便、重复性高等优势，可突破组织检测的局限性，更好地反应肿瘤基因突变的全貌，在消化系统肿瘤个体化、精准治疗中发挥重要作用，有广阔的应用前景，但其在临床应用中面临许多挑战，尚需要解决[54]：①临床对于ctDNA目前还没有统一的提取和检测标准。②早期肿瘤中ctDNA水平低以及存在其他DNA的污染，要求检测ctDNA的技术具有高敏感性和高特异性。③液体活检存在技术困难[55]，如难以检测到某些重要的染色体畸变(如基因融合)。④检测费用高，患者经济负担重，如何改进技术、降低成本也是未来的难题。

5 结语与展望

在精准医疗的环境下，ctDNA为消化系统肿瘤学提供了一种新的诊断技术工具，是未来基础与临床研究的一个大趋势。随着对ctDNA的不断探索和检测技术的快速发展，ctDNA 在消化系统肿瘤的早期诊断、治疗靶点筛选、耐药监测、复发转移预测及预后判断等方面具有良好的应用前景，将在消化系统肿瘤的个体化、精准化医疗中发挥重要作用。但是目前ctDNA 检测尚无统一的标准，敏感性及特异性有待进一步提高，并需要大规模、前瞻性临床研究验证其可行性，在临床应用之前仍面临着相当大的挑战。