自噬与复发性流产关系的研究进展

孙佳宁，冯晓玲，赵小萱，李波

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院妇科，哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第三医院康复科，哈尔滨 150030)

近年复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)发病率呈上升趋势，为1%～5%[1]。RSA的病因通常包括染色体异常、母体解剖结构异常、子宫内膜感染、内分泌失调和免疫缺陷，但其潜在机制及部分RSA的病因仍不清楚。因此，寻找病因成为RSA防治的难点和关键点。据欧洲人类生殖与胚胎学会指南报道，在没有明确妊娠失败原因而试图生育的夫妇中，不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)的患病率高达50%～75%[2]。目前尚无明确的改善RSA病因不明患者妊娠结局的有效方法。RSA逐渐成为较难治疗的女性生殖障碍性疾病之一，可能引起不良妊娠结局，造成患者心理压力增加，严重威胁家庭和社会的和谐稳定。

自噬分为微吞噬、巨自噬和伴侣介导的自噬，其中巨自噬以形成双膜结构的自噬体为特征，其对细胞内降解的影响最大，也是研究最广泛和最深入的自噬形式。目前，自噬主要是适应性免疫的效应器和调节器，当细胞处于缺氧、营养缺乏、内质网应激、线粒体损伤、免疫信号或炎症刺激时，机体通过各种信号途径诱导自噬发生，以维持细胞正常代谢[3-4]。2016年，Yoshinori Ohsumi因对自噬机制的详细阐明而获得诺贝尔医学家奖，随后各学科学者们展开了自噬的相关研究。自噬失调存在于多种疾病中，包括恶性肿瘤、退行性疾病、传染病、心肌病、肥胖症、自身免疫性疾病等[5]。但目前鲜有自噬与RSA相关的文献报道，而自噬参与RSA发生发展的相关机制是研究RSA的新方向。现就自噬与RSA关系的研究进展予以综述。

1 自噬的概述

1.1自噬的概念 “自噬”一词最早源于希腊语，由诺贝尔生理学获奖者Christian de Duve在一次溶酶体研讨会上首次提出，翻译过来意为“自己吃掉自己”。1992年，日本学者Yoshinori Ohsumi在研究酵母时发现了自噬相关的分子机制。随后，自噬相关基因统一命名为ATG(autophagy-related gene)。1998年，美国学者Beth Levine等首次成功克隆出哺乳动物ATG，并将其命名为Beclin-1[6]。此后，自噬现象在生物医学界的影响力不断扩大，相关研究飞速发展。

1.2自噬的分型及功能 自噬是存在于真核细胞中的高度保守的生物学行为，通常指巨自噬，其对细胞内降解具有重要影响[7]，也是一种与妊娠相关疾病联系最密切的自噬机制。自噬体和溶酶体的融合后发生降解，导致氨基酸、核苷、脂肪酸和糖释放。许多ATG参与自噬的发生过程[8-9]。在这些基因中，ATG5主要参与自噬前体膜的延长和闭合，ATG和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)又称MAP1LC3，主要参与自噬体的发育和成熟，对吞噬细胞延长和最终自噬体形成方面具有重要作用。

自噬是一种程序化的细胞内自我降解过程，为保持细胞内蛋白质的平衡和内环境的稳态，细胞利用溶酶体通过自噬降解错误折叠或聚集的蛋白质、清除细胞内病原体和受损的细胞器，如线粒体、内质网和过氧化物酶体。除清除细胞内聚集体和受损的细胞器外，自噬还能促进细胞衰老和细胞表面抗原呈递，防止基因组不稳定和坏死[10]，可见，自噬对细胞内稳态和生物能量管理具有重要意义。

1.3自噬的发生过程 自噬的发生过程主要包括形成自噬体、自噬体与溶酶体融合和降解三个步骤[11]。自噬的发生可由多种反应引起，如应激、缺氧损伤、亚细胞器损伤和蛋白质聚集。所有的自噬调节因子中，哺乳动物雷帕霉素复合物1靶点被认为在自噬的发生过程中起关键作用，是自噬起始的调控分子，同时负调控哺乳动物雷帕霉素复合物1有助于自噬的发生。当机体处于能量匮乏、线粒体损伤等诱导刺激下，哺乳动物雷帕霉素复合物1失活，导致哺乳动物丝/苏氨酸激酶1激活，进而将哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)从细胞质转移到内质网中，诱导自噬体的起始。自噬体完成核化后，通过ATG12与ATG5结合系统、ATG8脂化系统完成下一步自噬延伸。ATG12-ATG5-ATG16L1复合物被募集到自噬体膜上，促进磷脂酰乙醇胺与LC3发挥脂化作用。LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合生成LC3Ⅱ，随后LC3Ⅱ与细胞膜结合，能够促进自噬体的形成[12]。LC3Ⅱ是成熟自噬体的结构成分，故常作为自噬的特异性标志物。自噬泡成熟后与溶酶体进一步融合形成自噬溶酶体，进而自噬体内的待降解物被降解和再循环[13]。

2 自噬与RSA

近年来，自噬与妇科疾病的关系备受关注，子宫内膜细胞存在自噬现象。自噬在子宫内膜相关生理和病理生理过程中发挥不可或缺的作用，包括月经周期、正常妊娠期时蜕膜化过程。自噬失调是多种子宫内膜相关疾病发病机制的基础，如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和不孕症[14-15]。随着研究的深入发现，细胞自噬在RSA的病理生理机制中发挥重要作用。

2.1自噬异常与RSA蜕膜细胞 孕期的自噬调节涉及胚胎、母体和母胎相互作用三方面，自噬过程可发生于蜕膜和滋养层细胞中。胚胎着床是哺乳动物繁殖过程中一个重要而复杂的过程，随着胚胎黏附、侵袭和浸润进入子宫内膜，子宫内膜间质细胞转化为蜕膜基质细胞(decidual stromal cell，DSC)的过程称为蜕膜化过程。上述过程对于形成平衡的母胎界面至关重要，能指导滋养层细胞入侵内膜和胎盘生长，成功蜕膜化促进了气体和营养物质的交换以及母体和胎儿之间的免疫调节。子宫内膜蜕膜化反应是妊娠成功的必要条件，为生长中的胚胎提供了生长因子和细胞因子，并可保护胚泡免受炎症和活性氧类的影响。

滋养层细胞的入侵和胎盘的形成是良好妊娠必不可少的条件，而蜕膜化不足被认为是自然流产的重要原因。Su等[16]研究证实，胚胎黏附反应发生在妊娠第4天的傍晚，与妊娠第4天相比，小鼠妊娠第5天和第6天子宫内膜自噬相关标志物LC3和ATG5的表达相对降低，表明自噬对妊娠早期胚胎着床起关键作用，尤其是胚胎附着于子宫内膜后的蜕膜化过程。

蜕膜自然杀伤细胞异常与RSA的发生密切相关，蜕膜自然杀伤细胞比例占早孕期母胎界面免疫细胞的70%以上，主要在蜕膜化、子宫血管重构和诱导免疫耐受等阶段发挥功能[17]。Lu等[18]的研究发现，与正常妊娠女性相比，URSA患者DSC的ATG5和LC3B表达水平降低，而自噬负相关蛋白泛素化蛋白质聚集体sequestosome 1水平较高，并提出蜕膜化过程自噬水平的增加是通过小眼畸形相关转录因子-肿瘤坏死因子受体超家族成员14-基质金属蛋白酶9轴促进DSC表面黏附分子的表达，从而促进自然杀伤细胞在蜕膜、血管重构、胎儿和胎盘发育中的黏附和滞留。此外，URSA发生的可能机制为DSC自噬能力不足导致的蜕膜自然杀伤细胞黏附和滞留性降低。自噬是细胞质“重生”的过程，是细胞增殖、分化和死亡的关键。mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/mTOR信号通路中一种不可分割的激酶。自噬的调控机制分为依赖mTOR途径和非依赖mTOR途径两类。既往研究表明，mTOR信号通路在早期胚胎发育和胚胎干细胞增殖中发挥重要作用[19]。Lu等[18]的动物研究发现，低剂量的雷帕霉素可促进自噬介导的自然杀伤细胞侵入自然流产模型小鼠DSC中，从而降低胚胎吸收率，避免流产的发生。

2.2自噬异常与RSA滋养细胞 滋养层细胞是胎盘组织的重要组成部分。滋养层细胞由细胞滋养层、合胞滋养层和中间滋养层3种细胞组成。在胎盘发育过程中，滋养层细胞的迁移和侵袭是胎盘血管生成的关键。有研究发现，自噬在滋养层细胞的增殖、分化、侵袭和血管重构中至关重要[20]。过度激活的自噬是程序性细胞死亡的一种非凋亡形式，自噬水平异常可能导致滋养层侵袭不足，是RSA发生的关键因素[21]。因此，自噬对胎盘和胎儿发育至关重要。国外相关研究发现，与正常妊娠者相比，RSA患者绒毛自噬活性水平明显降低[17]。究其原因可能是通过靶向调节胰岛素样生长因子-2和遗传印记基因PEG10，增加自然杀伤细胞的细胞毒性，抑制滋养细胞的侵袭能力，最终引发流产。另有研究显示，与正常妊娠者相比，URSA患者的绒毛组织表现出高水平的自噬相关蛋白活性[22]。

Hh信号通路在人类滋养层细胞、妊娠维持和胎盘发育中起关键作用[23]。Shh和Dhh是Hh信号通路的配体。Pan等[24]分离了早孕期正常人工流产者和RSA患者的绒毛组织，采用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法对标本进行检测发现，RSA患者绒毛组织中Shh信号明显受损，引起自噬激活和自噬泡积累，从而抑制滋养细胞运动，导致RSA患者异常胎盘血管消退，最终引发流产。

线粒体融合蛋白2是线粒体动态蛋白之一，通过调节呼吸链、线粒体膜电位，维持线粒体形态和功能的完整性[25]。研究发现，URSA患者绒毛组织中线粒体融合蛋白2表达水平低下，导致滋养层细胞的线粒体形态和功能明显受损，滋养层细胞的生物学功能障碍，提示线粒体融合蛋白2的低表达与早期URSA患者胎盘绒毛组织中自噬异常激活有关[22]。YY1(Yin Yang 1)是一种调节细胞骨架相关蛋白表达的转录因子，相关研究证实，YY1可参与调节母胎界面的滋养层侵袭性，并可直接靶向作用于长链非编码RNA浆细胞瘤变异体易位1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)的启动子区[26]。通过体外培养正常人工流产者和RSA患者原代绒毛组织发现，RSA组YY1和PVT1的表达明显低于正常人工流产组，其可能机制是YY1-PVT1通过调节mTOR途径介导的自噬影响滋养细胞的侵袭和黏附，YY1-PVT1-自噬轴可能参与维持正常妊娠，提示自噬参与RSA的发病机制[27]。因此，滋养层细胞自噬水平异常与RSA的发生有关，但自噬的增加或减少是否可能导致RSA仍有争议，需进一步探索和研究。

2.3自噬异常与其他类型流产 自然流产是早期妊娠最常见的并发症，发生率为17%～22%[28]。Avagliano等[29]发现，自然流产患者的绒毛标本中合胞体滋养层的自噬空泡浓度增加，且自噬表达较正常早孕组增强。

稽留流产又称过期产，是一种特殊类型的流产。Beclin-1是调控自噬的关键因子，可调节自噬体的形成，p62主要参与自噬体的降解。谢冰[30]和苗绘[31]的研究均认为，稽留流产患者绒毛及蜕膜组织中Beclin-1表达高于正常早孕流产组，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也增强，而选择性自噬受体p62表达水平低于正常早孕流产组，提示过度自噬可能诱导细胞凋亡，最终导致稽留流产的发生。低氧诱导的自噬主要通过介导缺氧诱导因子-1α/B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3信号通路实现，王银芳[32]采用免疫组织化学和蛋白印迹法检测正常早孕人工流产者和稽留流产患者绒毛组织缺氧诱导因子-1α、B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3、LC3蛋白的表达发现，稽留流产组缺氧诱导因子-1α及下游靶基因B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3的表达均低于正常早孕组，且稽留流产组绒毛组织LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著下降，进一步行透射电镜观察发现，稽留流产组绒毛组织中自噬体减少，结构不典型。另有研究认为，RSA患者宫腔上皮和间质中缺氧诱导因子-1α的表达高于正常早孕组，表明子宫内膜缺氧和血管化状态的改变可能是导致RSA的因素[33]。稽留流产与RSA的发生机制存在相似之处，目前稽留流产绒毛和蜕膜细胞自噬的关系仍存在一定争议，但可明确病理性妊娠母胎界面的自噬水平均出现异常。

3 自噬与其他妊娠相关疾病

自噬可从胚胎、母体、母胎免疫界面三方面影响妊娠：①胚胎方面，包括影响受精和胚胎发育过程及滋养层细胞的功能；②母体方面，主要是干扰母体蜕膜化过程；③母胎免疫界面[34]。综上，自噬水平的异常与多种妊娠并发症有关，如先兆子痫、胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)和早产。自噬对妊娠的调节有望成为妊娠并发症治疗的新型靶点之一。

3.1自噬与早产 早产指妊娠满28周至不足37周的分娩。自噬参与了早产的病理机制，可促进孕酮合成，进而抑制子宫收缩。有研究显示，孕鼠胎盘中自噬受到抑制后，环加氧酶2和前列腺素F水平升高，导致蜕膜衰老并发生早产，故推测自噬诱导剂雷帕霉素可防止早产的发生，自噬激活可能预防非细菌感染引起的早产[35]。

过度的免疫炎症反应是诱导早产发生的重要因素，ATG16L1是ATG5-ATG12复合自噬体形成的必要条件，ATG16L1基因敲除的巨噬细胞通过TIR结构域产生高水平的炎症细胞因子。Hirota等[36]证实，子宫和胎盘中ATG表达降低。另有研究证实，早产患者胎膜中自噬相关蛋白Beclin-1以及ATG16L1的表达均低于足月女性，故认为炎症介导早产的自噬水平较低[37]。

3.2自噬与先兆子痫 子痫是造成孕产妇死亡的重要原因之一，其中先兆子痫对孕妇和胎儿的影响极大，至今先兆子痫的发病机制仍不清楚。研究证实，先兆子痫患者胎盘组织中的自噬抑制标志物p62在绒毛外滋养细胞中呈高表达，提示在先兆子痫患者胎盘绒毛外滋养细胞中存在自噬抑制现象[38]。其可能机制是可溶性内皮素抑制了滋养细胞的侵袭，并且先兆子痫患者的血管重构功能的损伤受自噬水平抑制和转化生长因子-β1信号转导阻断的影响。另有研究证实，与先兆子痫患者相比，正常妊娠妇女间质绒毛外滋养细胞中自噬抑制因子sequestosome 1无表达，而先兆子痫患者间质绒毛外滋养细胞中呈明显高表达[39]。由此可见，先兆子痫患者间质绒毛外滋养细胞中的自噬激活功能受损，降低了间质绒毛外滋养细胞的侵袭能力，导致细胞内稳态受到破坏，细胞侵袭不足引起的胎盘缺血缺氧引发血管重构不足，导致先兆子痫发生。

3.3自噬与FGR FGR通常指妊娠37周后分娩胎儿的出生体重低于同胎龄胎儿出生体重均值的两个标准差或低于同龄胎儿正常体重的10%，是围生期的主要并发症之一。目前，全球FGR发病率为5%～10%，此类患儿糖尿病、高血压和心脏病的患病风险增加[40]。Zhang等[41]的研究显示，FGR胎盘的Beclin-1和LC3BⅡ表达增强，自噬过度激活，滋养层内皮细胞和基质细胞的自噬空泡表达更丰富，推测过度激活的自噬可直接损害滋养层细胞，从而导致绒毛血管化减少，胎盘灌注不足，引起胎儿氧气和营养缺乏。ATG9a为介导自噬体形成关键因子，Kojima等[42]的研究发现，敲除ATG9a纯合基因小鼠的幼鼠体重明显低于ATG9a杂合基因敲除幼鼠或野生型幼鼠。

4 小 结

自噬是一个多步骤、极其复杂的过程，在不同的状态、部位、细胞、疾病过程中，具有不同的信号通路和生物学功能。目前自噬与RSA的研究已从动物模型扩展到人体活组织中，由于自噬过程是动态的，难以明确RSA样本发生自噬反应的时间。自噬在RSA中的信号转导通路和分子机制仍有待探讨。目前有关自噬与RSA关系的研究逐渐增加，细胞自噬过度以及自噬不足均导致RSA患者胚胎不能正常黏附、侵袭和浸润并进入子宫内膜，或导致滋养细胞的生物学功能障碍，进而破坏母胎界面的自噬功能平衡，引发RSA。由此可见，自噬调节可能为RSA等妊娠疾病的诊疗提供新的、有价值的研究思路和方向。