复合发酵法优化低盐黑豆酱油风味研究

冉伟，姜婷婷，李兴华，李想

(四川旅游学院，成都 610100)

目前酱油的酿造方法主要为高盐稀态发酵工艺和低盐固态发酵工艺两种，通常采用黄豆和黄豆粕为原料[1]。低盐固态发酵工艺相对于高盐稀态发酵工艺具有发酵温度高、生产周期较短、通过发酵剂添加能有效地保证生产过程稳定、提高原料的利用率等特点，目前被国内大部分生产企业选用[2]。同时因在发酵过程中盐的添加量相对较低，符合目前低盐健康的生活理念，低盐固态发酵工艺制备的酱油深受消费者喜爱[3]。但是其风味物质含量及口味不及高盐稀态发酵工艺制备的酱油。如何改善低盐发酵酱油的风味成为目前亟需解决的问题。

复合发酵法是食品工业生产领域常用的一种风味改良方法，生物发酵剂的添加能有效去除酱油在制备过程中产生的异味，同时还能丰富其风味物质种类及含量，达到改善口味的目的[4]。目前酱油生产企业多采用多菌种混合发酵的方式，实现菌种互补、缩短发酵时间及改善发酵效果。房峻等[5]通过强化嗜盐四联球菌，添加鲁氏接合酵母菌改善酱油品质，有效提高了酱油样品中氨基酸和有机酸含量，挥发性风味物质种类总量提高2.4倍；邓岳等[6]通过多菌混合制曲制备酱油，特征性风味物质含量均高于传统非添加菌种酱油，酱油品质得到了有效改善。目前，采用复合发酵法优化低盐酱油工艺的研究相对较少。

嗜盐四联球菌是一种中度嗜盐菌，能够在发酵过程中产生高浓度乳酸，对发酵速度和成品呈味物质含量有一定影响[7]。鲁氏接合酵母在酱油的制备过程中能产生多种风味物质，使酱油醇厚的香气增加。本研究选取富含不饱和脂肪酸、膳食纤维等生物活性物质且抗氧化效果较好的黑豆替代传统黄豆为原料，在传统低盐固态发酵工艺基础上添加嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母菌进行发酵，以感官评定和氨基态氮含量为指标，通过单因素试验结合响应面优化复合发酵法制备低盐黑豆酱油的最佳工艺，并对比分析其与传统工艺制备的低盐黑豆酱油品质差异，为相关企业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆、麸皮：购于中粮集团有限公司；米曲霉3.042 (Aspergillusoryzae3.042)：购于成都市青羊生物科技有限公司；嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)、鲁氏接合酵母(Saccharomycesrouxii)：购于美国QLED公司；氨基酸标样、酵母膏、胰蛋白胨、MRS 培养基等：购于成都瑞星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

XRP100电子天平 梅特勒-托利多国际有限公司;BJPX88恒温培养箱 济南鑫贝西生物技术有限公司；UV-4430紫外可见光分光光度计 青岛明博环保科技有限公司；GBQ100L发酵罐 山东双子机械工程有限公司；高效液相色谱仪 深圳市鸿永精仪科技有限公司；API 5000液质联用仪、气质联用仪 谱质分析检测技术(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 低盐黑豆酱油制备工艺

1.3.1.1 制曲工艺

将黑豆浸泡8 h，放入蒸锅中蒸45 min，添加1.5倍的水后再于123 ℃灭菌15 min，按6∶4的比例将黑豆和麸皮混合，接种0.5%的酱油曲精，搅拌均匀后放入培养箱内，在温度32 ℃、湿度75%的条件下制曲48 h，每8 h翻曲1次。

1.3.1.2 发酵工艺

成曲样品粉碎，按1∶2的比例将粉碎后的样品与盐水(100 g/L NaCl)混合，放入发酵罐中进行发酵，期间每天搅拌1次。传统制备方法在30 ℃条件下自然发酵120 d。复合发酵法按试验设计的发酵温度、发酵时间进行发酵，其中在发酵0 d添加鲁氏接合酵母，在发酵10 d添加嗜盐四联球菌。

1.3.2 单因素试验设计

在预试验基础上，复合发酵法制备的低盐黑豆酱油的条件：发酵时间80 d，发酵温度30 ℃，鲁氏接合酵母菌接种量2%，嗜盐四联球菌接种量1%。在其他条件不变的前提下对单个因素不同梯度进行单因素试验，分析其对感官品质及氨基态氮含量的影响。各因素单因素试验水平：发酵时间60，65，70，75，80，85，90，95，100 d，发酵温度26，27，28，29，30，31，32，33，34 ℃，鲁氏接合酵母菌接种量1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%，嗜盐四联球菌接种量0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%。

随着我国城市化的推进，物业管理企业也逐渐的从大城市普及到了中小城市，随之而来的竞争也日益激烈，为了争夺资源，物业管理公司都想尽办法来扩大资源，物业管理的覆盖面积不断增大，这就需要更多的人力。除此之外，监控线延长带来的管理上的困难也可想而知，相应的管理成本也会随之增长。

1.3.3 响应面优化设计

根据单因素试验结果，确定发酵时间、发酵温度、鲁氏接合酵母菌接种量和嗜盐四联球菌接种量等因素对低盐黑豆酱油品质影响较大的水平，运用Design-Expert 13软件进行响应面试验设计，并确定试验方案，建立回归方程预测模型，确定最佳工艺条件。具体因素及水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.3.4 感官评价

通过对低盐黑豆酱油的感官属性进行分析，确定感官评价标准，分别从色泽、气味、滋味和形态4个方面进行评价，具体见表2。选取10名具有食品科学等相关专业背景的感官评价员，其中男5名，女5名,年龄在18～22岁，在评价前进行统一培训。样品用相同的器皿盛装，置于45 ℃水浴锅中加热5 min，随机抽样评价，取评分平均值为最终评分。

表2 感官评定标准Table 2 The sensory evaluation standard

1.3.5 其他理化指标测定

氨基态氮含量测定参考胡伊等[9]的方法，采用高氯酸非水滴定法；氯化钠的测定参考董淑杰等[10]的方法，采用离子色谱-电导法；可溶性无盐固形物的测定参考尹乐斌等[11]的方法，采用直接干燥重量法；游离氨基酸含量的测定参考褚千千等[12]的方法，采用三硝基苯磺酸法测定；有机酸含量的测定参考于敏等[13]的方法，采用高效液相色谱法测定；挥发性风味物质的测定参考袁尔东等[14]的方法，采用固相微萃取联合气质联用技术(SPME-GC-MS)进行测定。

1.4 数据处理

试验结果用平均值表示，使用Excel 2010软件进行作图和数据分析。

2 结果与分析

2.1 复合发酵法优化低盐黑豆酱油工艺条件

2.1.1 单因素试验

复合发酵法优化低盐黑豆酱油单因素试验结果见图1～图4。

图1 发酵时间对氨基态氮含量和感官评分的影响Fig.1 The effect of fermentation time on the content of amino nitrogen and sensory score

由图1可知，随着发酵时间的延长，感官评分和氨基态氮含量均呈上升趋势，发酵时间为90 d时，感官评分达到最大值96.12，此时氨基态氮含量为(8.25±0.12) mg/mL，说明此时低盐黑豆酱油风味最佳。随着发酵时间的延长，二者均呈下降趋势，主要受发酵后期有机酸等次生代谢物的影响，导致风味品质下降。综合分析，发酵时间为90 d时品质最佳。

图2 发酵温度对氨基态氮含量和感官评分的影响Fig.2 The effect of fermentation temperature on amino nitrogen content and sensory score

由图2可知，发酵温度为30 ℃时感官评分和氨基态氮含量最高，29 ℃和31 ℃次之，温度过低，低盐黑豆酱油的微生物代谢缓慢，影响风味物质的形成，温度过高又会抑制微生物的代谢活动，导致风味物质浓度降低，发酵温度为30 ℃时品质最佳。

图3 鲁氏接合酵母菌对氨基态氮含量和感官评分的影响Fig.3 The effect of Saccharomyces rouxii on the content of amino nitrogen and sensory score

图4 嗜盐四联球菌对氨基态氮含量和感官评分的影响Fig.4 The effect of Tetragenococcus halophilus on the content of amino nitrogen and sensory score

由图3和图4可知，随着两种菌接种量的增加，感官评分和氨基态氮含量均呈先上升后下降的趋势，鲁氏接合酵母菌接种量为1.9%时，其感官评分为95.16，氨基态氮含量为(8.21±0.32) mg/mL，嗜盐四联球菌接种量为1.2%时，其感官评分为96.12，氨基态氮含量为(8.42±0.18) mg/mL，发酵菌种的添加对低盐黑豆酱油中微生物代谢有较大影响，在发酵过程中能有效分解黑豆蛋白质，产生氨基酸等小分子化合物，直接影响低盐黑豆酱油滋味，也是判断发酵程度的重要指标，综合分析，鲁氏接合酵母菌接种量为1.9%时品质最佳，嗜盐四联球菌接种量为1.2%时品质最佳。

2.1.2 响应面优化试验结果分析

表3 响应面设计与结果Table 3 Response surface design and results

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

续 表

由表3可知单因素试验最佳结果，复合发酵法制备低盐黑豆酱油的最佳工艺条件为发酵时间90 d、发酵温度30 ℃、鲁氏接合酵母菌接种量1.9%、嗜盐四联球菌接种量1.2%。采用Design-Expert 13软件进行处理分析。根据方差分析结果除去不显著项得到模型的二次多项回归方程为Y=-9819.8875+26.20167A+440.325B+1793.91667C+670.83333D-0.045AB-1AC+0.6AD-17.5BC+2BD+40CD-0.131667A2-6.76667B2-315.41667C2-352.91667D2。

由表4可知，模型的P值小于0.0001，差异极显著，失拟项的P值为0.2216，差异不显著，表明模型是极显著的。因素A、B、AB、AC、AD、BC、BD、CD对结果影响不显著(P>0.05)；因素D对结果影响显著(P<0.05)；因素C、A2、B2、C2、D2对结果影响极显著(P<0.01)；RAdj2为92.74%，说明模型中残差相互独立，拟合度良好，试验误差小，可以用于复合发酵法制备低盐黑豆酱油的最佳工艺条件优化与预测。

2.1.3 响应曲面图分析与结果优化

根据回归方程的分析结果，考察复合发酵法制备低盐黑豆酱油工艺条件的发酵时间、发酵温度、鲁氏接合酵母菌接种量、嗜盐四联球菌接种量4个因素的交互作用对配方的影响，具体见图5～图10。通过Design-Expert 13得回归模型提取复合发酵法制备低盐黑豆酱油的最佳配方方案：发酵时间90 d、发酵温度30 ℃、鲁氏接合酵母菌接种量1.964%、嗜盐四联球菌接种量1.2%，模型预测所得的感官评分为96.1；考虑到试验条件，将复合发酵法制备低盐黑豆酱油最佳配方方案修正为发酵时间90 d、发酵温度30 ℃、鲁氏接合酵母菌接种量1.9%、嗜盐四联球菌接种量1.2%。为了进一步检验预测结果的可靠性，在修正后的最佳配方条件下进行3次平行试验，平均感官评分为95.88，与模型预测所得的感官评分相对误差为0.0127，与预测值具有良好的吻合性，可以用于实际生产。

图5 A与B交互影响响应面图Fig.5 Response surface diagram of interaction between A and B

图6 A与C交互影响响应面Fig.6 Response surface diagram of interaction between A and C

图7 A与D交互影响响应面图Fig.7 Response surface diagram of interaction between A and D

图8 B与C交互影响响应面图Fig.8 Response surface diagram of interaction between B and C

图9 B与D交互影响响应面图Fig.9 Response surface diagram of interaction between B and D

图10 C与D交互影响响应面图Fig.10 Response surface diagram of interaction between C and D

2.2 复合发酵法与传统发酵法制备的低盐黑豆酱油品质比较

2.2.1 氯化钠、可溶性无盐固形物含量及感官评分比较

酱油中氯化钠浓度对酶的代谢影响较大，浓度过高会制约酶的分解，浓度过低又不能有效抑制杂菌的生长，一般浓度在6～8 mg/mL适宜[15]。对比分析复合发酵法和传统发酵法制备的低盐黑豆酱油，氯化钠含量分别为6.89 mg/mL和7.21 mg/mL，差异不显著，均在合理范围内，两种方法在制备过程中均按相同比例混合，受发酵时间及温度等因素影响，水分蒸发，直接影响成品中氯化钠浓度。可溶性无盐固形物主要是原料的分解物，其含量越高说明成品品质越好。由图11可知，复合发酵法制备的低盐黑豆酱油无盐固形物含量为20.12 mg/mL，高于传统发酵法16.9%，达到特级酱油标准20 mg/mL。感官评价结果为消费者最直接的感受，评分增加了5.5%，说明复合发酵法工艺优化有效提升了低盐黑豆酱油的发酵品质。

图11 两种发酵方法的氯化钠、可溶性无盐固形物含量及感官评分Fig.11 Sodium chloride, soluble salt-free solid content and sensory score of black bean soy sauce prepared by the two fermentation methods

2.2.2 游离氨基酸含量比较分析

游离氨基酸是低盐黑豆酱油鲜味的主要来源，是评价其品质的主要指标，复合发酵法与传统发酵法制备的低盐黑豆酱油游离氨基酸含量见表5。

表5 两种发酵法的游离氨基酸含量Table 5 Free amino acid content of black bean soy sauce prepared by the two fermentation methods mg/dL

由表5可知，传统方法制备的低盐黑豆酱油中游离氨基酸总量为45.41 mg/dL，其中鲜味氨基酸含量为11.7 mg/dL，占总量的25.75%，甜味氨基酸含量为4.36 mg/dL，占总量的9.6%；接种了鲁氏接合酵母菌和嗜盐四联球菌的低盐黑豆酱油中鲜味氨基酸含量为15.56 mg/dL，相比传统发酵法增加了32.99%，甜味氨基酸含量为5.6 mg/dL，相比传统发酵法增加了28.44%；综合分析，低盐黑豆酱油在发酵过程中添加菌种后，游离氨基酸总量有了显著提升，特别是直接影响低盐黑豆酱油鲜甜味的氨基酸含量增加显著，能更好地改善复合发酵法制备的低盐黑豆酱油品质。

2.2.3 有机酸含量比较分析

表6 有机酸含量Table 6 Organic acid content mg/dL

酱油中的有机酸能有效改善酱油的滋味，其含量差异对酱油的口感和质量有直接的影响[16]。由表6可知，复合发酵法优化工艺制备的低盐黑豆酱油共有柠檬酸、酒石酸、丙酸、苹果酸、乳酸和乙酸6种有机酸，总量比传统发酵法制备的低盐黑豆酱油高15.55%。其中具体改善酱油风味和能有效防腐抑菌的苹果酸、乳酸、乙酸和丙酸等含量高于传统低盐黑豆酱油54.51%，说明工艺优化与鲁氏接合酵母菌和嗜盐四联球菌接种对其品质改良具有积极的意义。

2.2.4 挥发性风味物质比较分析

表7 挥发性风味物质的种类Table 7 Types of volatile flavor substances 种

通过对两种方法制备的低盐黑豆酱油样品中挥发性风味物质的检测与分析，由表7可知，传统发酵法制备的低盐黑豆酱油与复合发酵法制备的低盐黑豆酱油所检测到的挥发性风味物质种类差异较大，复合发酵法挥发性风味物质总量达69种，比传统发酵法多20种，说明通过工艺优化，添加鲁氏接合酵母菌和嗜盐四联球菌能有效提升酱油中挥发性风味物质的种类，更有利于酱油的滋味调和。

3 结论

添加鲁氏接合酵母菌和嗜盐四联球菌的复合发酵法，在改善低盐黑豆酱油品质方面具有积极的作用。在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 13软件建立以感官评分为指标的二次多项式回归模型，用响应面法优化得最佳工艺：发酵时间为90 d，发酵温度为30 ℃，鲁氏接合酵母菌接种量为1.9%，嗜盐四联球菌接种量为1.2%，按该工艺条件生产的低盐黑豆酱油品质最佳，感官评分为95.88，氨基态氮含量为8.45 mg/mL。并对最佳工艺条件生产的低盐黑豆酱油与传统发酵法制备的低盐黑豆酱油在品质上进行了对比分析，研究发现，复合发酵法制备的低盐黑豆酱油在氯化钠含量、可溶性无盐固形物含量及感官评分上均优于传统发酵法制备的低盐黑豆酱油，达到特级酱油标准；在生产过程中添加菌种的低盐黑豆酱油游离氨基酸总量有了显著提升，特别是直接影响低盐黑豆酱油鲜甜味的氨基酸含量增加显著，有机酸总量比传统发酵法制备的低盐黑豆酱油高15.55%，挥发性风味物质总量达69种，比传统发酵法多20种，说明其能更好地改善低盐酱油的品质。本研究为相关企业生产提供了理论依据。