鸭茅单拷贝核基因RPB1引物设计及筛选

安明珠 朱文露 彭亚萍 韩 博 周 凯

云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201

鸭茅（Dactylis glomerataL.），又名果园草（Orchardgrass）或鸡脚草（Cocksfoot），是禾本科（Poaccae）鸭茅属（Dactylis）的唯一物种[1]。鸭茅的耐阴性较强、叶产量高[2]，是畜牧业发展和改良环境的重要牧草草种之一，在青贮饲料的制备[3]、草地恢复[4]等方面广泛应用。

野生鸭茅的种质资源丰富，遗传多样性较高，是进行育种及物种保护的重要基因材料来源[2]。目前，国内外对于鸭茅的起源及进化的研究集中于地理学数据和形态学标记[5]、分子标记[6]以及叶绿体和ITS 序列[7]数据之上。随着鸭茅生存环境的变化，形态学分类和分子标记技术受外界影响较大，对物种分类会造成一定的误差[8]。单拷贝核基因属于直系同源基因，继承双亲的遗传信息，没有核苷酸偏向性和内部重复，携带大量的信息位点，进化速率中等，更适合用于对物种进行系统发育分析[9]。武泼泼等[10]基于单拷贝核基因DMC1 基因序列对中国短柄草种族进行分类研究，为其系统进化提供可靠证据。胡晓艳等[11]利用单拷贝核基因对酸枣的遗传多样性进行研究，证明单拷贝适用于物种遗传多样性应用，这为后续的酸枣种质资源保护及利用奠定了基础。刘舒宇等[12]通过设计并筛选出杨柳科单拷贝核基因DSH引物，并对4 个属的代表物种进行系统发育分析，为进一步深入了解杨柳科植物的遗传多样性提供数据支撑。Joly 等[13]开发了单拷贝核基因GAPDH作为核基因标记，重构了北美蔷薇属植物的多倍体起源。李爽等[14]基于单拷贝核基因PAL检测到贵州金花茶具有低水平的遗传多样性和中等水平的遗传分化，从而为最大程度保护贵州金花茶的遗传多样性奠定数据基础。RPB1基因属于单拷贝核基因，是RNA 聚合酶Ⅱ上最重要的大亚基，其拷贝数较低，广泛应用于群体遗传进化研究中，以揭示居群遗传多样性和遗传分化[14-16]。

目前，在鸭茅的系统发育分析上，单拷贝核基因RPB1还未曾应用，因此本研究通过设计鸭茅单拷贝核基因RPB1的引物，并对筛选后的引物退火温度进行优化，从而用于后续进一步探索鸭茅不同亚种间的亲缘关系，此结果对鸭茅的起源进化和资源保护具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验材料为种植于云南省曲靖市马龙区马鸣市鸭茅圃的鸭茅亚种D.glomeratasubsp.woronowii和D.glomerata subsp.hispanica。在2020 年7 月收集鸭茅新鲜叶片，使用变色硅胶进行干燥保存，用于植物DNA 提取。

1.2 试验方法

1）植物DNA 的提取。使用北京天根生物科技有限公司提供的Ezup 柱式植物基因DNA 提取试剂盒提取鸭茅叶片DNA，具体方法参考其说明书。称取30～50 mg 鸭茅叶片，加入液氮快速研磨至粉末，然后通过试剂盒中的药品进行溶解并提取，最终得到鸭茅DNA。提取后的DNA 样用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测合格的样品放置-20 ℃冰箱中进行保存。

2）引物设计。鸭茅RPB1 基因序列由四川农业大学张新全教授提供，利用Beacon Designer v.8 和Primer Blast 软件设计鸭茅单拷贝核基因RPB1 引物序列，记录其引物名称、碱基序列、引物长度、退火温度（表1）。将引物送到公司进行合成干粉，并按照要求将浓度稀释为100 μmol/L。

表1 引物序列

3）PCR 扩增及琼脂糖凝胶检测。通过PCR 扩增技术，将退火温度设置为12 个梯度，具体温度以记录的温度为标线，上下调整10 ℃作为引物退火温度区间。PCR 反应体系（50 μL）：2.5μL DNA 样（10 ng/μL），2.5 μL 上游引物（10 μmol/L），2.5 μL下游引物（10 μmol/L），25 μL Mix Taq PCR Master（1x），用去离子水补足至50 μL。扩增程序为：94 ℃3 min，94 ℃30 s，Tm 30 s，72 ℃1 min，35 X，72 ℃8 min，4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下进行观察，根据条带的清晰程度以及特异性与否，筛选出最适的引物对及退火温度，用于后续试验。

4）测序。将符合要求的PCR 产物送到上海生工生物有限公司进行测序，然后通过chromas 查看峰图，并在NCBI 数据库中Blast 进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 引物及退火温度的筛选

通过对10 对引物进行PCR 扩增，并设置12 个退火温度梯度，发现经琼脂糖凝胶电泳检测后发现RPB1（3F，3R）、RPB1（4F，4R）2 对引物能够扩增出明亮的1 条带且在58 ℃时最为明显，说明这2 对引物设计合理，特异性较强。

2.2 引物序列峰图分析

将得到的引物序列通过chromas 软件后，每个序列得到1 个峰图。通过峰重叠情况来判断此引物序列是否能用于鸭茅系统发育分析。正常峰的峰图序列连续，且无重叠峰和无poly 结构，峰图结构明显清晰，为合适的引物序列；重叠峰的峰图中有大量的重叠，说明在测序反应之后产生了不止1 条序列，则说明该引物设计不合格；poly 结构峰图为出现连续单个碱基重复，会造成重叠峰，甚至造成反应中断，测序失败，不是合适的引物序列。如图2 所示，所选引物的峰图均为正常峰，无重叠峰。

2.3 测序及验证

在NCBI 库中输入获得的序列信息进行Blast 比对（图3），2 对引物扩增的产物均为目的基因片段。

3 讨 论

鸭茅物种及亚种间明确的分类地位和系统发育关系，是鸭茅种质资源更好地保存和利用的依据，是现代牧草品种选育和改良的必要理论基础之一。不同倍性的鸭茅亚种同域共生，形态上较为相似，随着环境的变化，鸭茅的形态也随之发生改变，这导致对鸭茅进行传统形态学分类存在一定的误差[17-19]。分子标记技术从一定程度上避免了这种误差，但由于分子标记技术的费用较贵且耗时长，所以在物种的遗传多样性研究中未普遍应用[20-21]，基于叶绿体基因建立系统发育树的分析报道较少[22]，而对于从核基因方面进行鸭茅系统发育分析未见相关报道。

鸭茅的分类阶元较低，需要一些进化速率较快且变异位点较多的基因来研究鸭茅的系统发育问题。核基因的进化速率快于叶绿体基因和线粒体基因，基因序列在进化过程存在丰富的变异位点，为研究种间或属间系统发育分析提供可用的变异信息[23]。RPB1 属于单拷贝核基因，广泛应用于群体遗传进化研究中[14-16]。燕薇等[24]利用RPB1 基因对蓝叶虫微孢子虫进行系统发育分析研究，进一步证实了亲缘关系分类。李银双等[25]利用RPB1 对羊肚菌进行系统发育分析，为其准确分类提供了科学分类。

本试验通过设计单拷贝核基因RPB1 引物，优化其退火温度，这为后续研究鸭茅不同亚种之间的起源和亲缘关系奠定基础。设计的10 对鸭茅单拷贝核基因RPB1 引物，筛选出2 对扩增产物条带单一且扩增效果较好的引物，通过温度梯度PCR 筛选了退火温度为58 ℃，通过测序和Blast 比对验证了其对应的目的基因。