血液样本在禽病实验室检验中的应用

2022-12-18关文怡王喜顺

养殖与饲料 2022年2期

关文怡谭晨王喜顺

1.北京农业职业学院，北京 102442；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；3.北京市延庆区农业农村局，北京 102100

随着养禽业的发展，家禽个体间密切接触，病原广泛分布，使得禽病表现出疾病种类多、群发性强、并发症多、继发感染复杂的特点，仅依靠流行病学、临床症状、病理剖检等方法已不能作出准确的诊断，实验室检验已成为准确诊断禽病的重要依据。血液样品的采集、制备与保存是实验室检验工作的重要准备，是保证准确诊断的基本条件。因此，家禽血液样本的采集技术、制备方法、保存条件及准确应用是禽病实验室诊断和禽病监测的核心技术，是兽医及时作出诊断结论、评估禽群免疫抗体水平、掌握疾病与疫情动态的科学依据。

1 禽病的实验室诊断

常见禽病主要有禽传染病、禽寄生虫病和禽常见代谢与中毒病。在禽病日常诊断中，大多通过流行病学诊断、临床检查、病理剖检诊断可对一般禽病作出初诊，但当禽病未出现典型症状和病理变化时或需要作出确诊时，就需要借助实验室方法进行诊断。禽病的实验室诊断包括病原学诊断和血清学诊断2 种方法[1]。

1.1 病原学诊断

禽病的病原学诊断包括禽病的细菌学检验、禽病的病毒学检验和禽寄生虫病检验3 部分。细菌学检验的主要方法有细菌的涂片、染色、镜检，细菌的生化特性鉴定和药敏试验等。病毒学检验主要是通过动物接种、鸡胚培养和组织细胞培养进行病毒的分离培养及通过电镜检查、补体结合试验、沉淀反应、荧光抗体和酶标抗体检测等方法进行病毒的鉴定。禽寄生虫病检验主要是用涂片法、沉淀法、漂浮法进行的虫卵检查和分离法、培养法、染色法进行的虫体检查等方法。

1.2 血清学诊断

血清学诊断是利用免疫学中抗原抗体反应为基本原理的一类用于细菌、病毒、寄生虫的分类、鉴定及抗原分析等方面的诊断技术。用已知的抗体对分离获得的病原体进行鉴定，也可用已知的抗原对已康复的或隐性感染的家禽及免疫接种后的家禽的抗体进行定性或定量的测定。主要技术包括凝集试验、沉淀试验、血凝与血凝抑制试验、红细胞吸附与吸附抵制试验、补体结合试验、病毒中和试验和免疫标记技术等。

2 家禽采血技术

在禽病的诊断、治疗、疫情监测、免疫抗体水平监测工作中，都需要采集家禽的血液样本进行实验室检验。采血方法的选择，主要取决于采血的目的、所需血样或血清的数量以及家禽的种类、年龄等。家禽的采血方法主要有以下几种[2]。

2.1 冠髯采血

冠髯采血指将冠髯消毒后，用针头直接刺破冠髯，挤出血液的采血方式。此法适用于用血量少、直接取用的试验项目，多用于全血平板凝集试验、血细胞性状检查、寄生虫和微生物的血涂片检查等。

2.2 跖骨内侧静脉采血

跖骨内侧静脉采血，指在消毒跖骨内侧静脉的一定范围，持注射器与跖骨皮肤呈10°角顺跖骨内侧静脉方向进针取血。适用于水禽和4 周龄内雏禽。

2.3 静脉采血

家禽静脉采血有翅静脉采血和颈静脉采血2种方式。由于家禽颈静脉采血技术要求高，左右手配合要得当，力度适当才能完成，因此，临床常用翅静脉采血。翅静脉采血是将翼下静脉术部消毒后，由翼根的肌肉处进针，向翅膀方向斜向刺入翼下静脉，抽取血液的方式。此法可一次取血5～8 mL，用于用血量较大的试验，多用于血凝与血凝抑制试验中的红细胞悬液配备及其他血清学检查中禽血清的制备[3]。

2.4 心脏采血

家禽心脏采血分为雏鸡心脏采血和成年鸡心脏采血2 种方式。

1）雏鸡心脏采血。将鸡的锁骨胸腔入口处消毒，持采血器以平行于颈椎的方式从胸腔入口处进针，抽取血液。此法取血量少于2 mL，适合5 周龄以下的雏鸡。

2）成年鸡心脏采血。将左胸壁消毒，持采血器于胸骨嵴突与肩胛骨末端连线中点处垂直进针，抽取血液。此法采血量大，出血快，适用于2 月龄以上的成年鸡和用血量大的试验。

3 血液样本在实验室检验中的应用

在兽医临床检验中，血液样本分为全血、血浆、血清3 种[4]。

3.1 全血的应用

全血是将血液采集到采血器材内所形成的混合物，包括血细胞和血浆的所有成分，适用于临床血液学检查。在禽病诊断中应用全血的项目主要有血液涂片检查、血常规检查、全血平板凝集试验、红细胞悬液制备等。

1）血液涂片检查。制备血液涂片用血量少，可采用刺破冠髯、脚蹼皮下静脉等组织，以接种环或吸管直接取新鲜的血液，在载玻片上推出一层薄、透、均的血膜，经瑞姬氏法染色后，用显微镜检查。此方法可用于禽细菌性疾病的诊断，如大肠杆菌、禽霍乱、弯曲杆菌病、葡萄球菌病、鸭疫里氏杆菌病等，以及禽住白细胞虫病的检查。

2）血常规检查。进行血常规检查时用血量少，若可以在实验室采血，可采用刺破冠髯、脚蹼皮下静脉等组织，以毛细吸管直接取新鲜的全血，放入全自动血液细胞分析仪中，测定血常规指标。若需采血送检，可采用翅静脉采血，采血器中加抗凝剂，将抗凝全血送至实验室检测。此方法可为禽铁缺乏症、中毒病（棉籽饼中毒、鱼粉中毒）等确诊提供依据。

3）全血平板凝集试验。进行平板凝集试验时用血量少，可采用刺破冠髯、脚蹼皮下静脉或翅静脉采血，取全血50 μL 与抗原50 μL 均匀混合，出现颗粒状、片状或团块状凝集时，判定为阳性反应。此方法用于鸡白痢沙门氏菌病、鸡毒支原体感染的诊断，也用于禽结核的检疫。

4）红细胞悬液制备。在进行部分凝集试验和吸附试验时，需滴加红细胞悬液，制备红细胞悬液可采用翅静脉或心脏采血，需血量较大，采集需要量的抗凝血，注入离心管中，加入等体积的阿氏液混合，用中性PBS 液洗涤3 次，将洗涤后的红细胞配成试验所需的鸡红细胞悬液。此方法主要用于间接血凝试验和间接血凝抑制试验、血凝试验和血凝抑制试验及红细胞吸附和红细胞吸附抑制试验等。

3.2 血浆的应用

血浆是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀所获得的不含细胞成分的液体，适用于血浆生理性和病理性化学成分的测定。可采用翅静脉或心脏采血，需血量较大，采集需要量的抗凝血，注入离心管中，经离心分离取上层淡黄色液体，放入全自动血液生化仪中测定目标项。此方法可为禽中毒病（食盐中毒）、营养缺乏症、维生素缺乏症、微量元素缺乏症等病症的确诊提供依据。

3.3 血清的应用

血清是离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，适用于临床血清学和免疫学检验。可采用翅静脉或心脏采血，需血量较大，将采取的血液样品试管呈最大斜面倾斜，并置室温或37 ℃温箱或水浴中预温0.5 h，促使血清析出。待大部分血清析出后，中速(2 000～2 500 r/min)离心5 min，分离血清。用移液器将血清吸移到另一清洁而干燥的试管里，贴上标签。放4 ℃冰箱保存待用，若不能及时检测，可放入-15 ℃冰箱中冻存，需用时血清从低温冰箱取出，经4 ℃冰箱、室温、37 ℃水浴条件逐步均匀融解，血清完全融解混匀后使用。解冻血清不宜反复冻融。血清在禽病诊断中主要用于以下试验[5]。

1）凝集试验。凝集反应即细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体在电解质参与下, 抗原颗粒相互凝集形成团块，这种现象称为凝集反应。参与反应的抗体称为凝集素，抗原称凝集原。常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集法等。可用于禽传染性鼻炎、禽弯曲杆菌病、禽传染性滑膜炎等病的诊断。

2）沉淀试验。抗原与相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中会自由扩散，形成肉眼可见的沉淀带称为免疫琼脂扩散试验（沉淀试验）。可用已知抗原沉淀未知抗体，也可用已知抗体测定未知抗原，特异性强，可用于禽流感、禽霍乱、鸡白痢、马立克、传染性法氏囊炎、传染性支气管炎、传染性鼻炎、传染性脑脊髓炎、病毒性关节炎、鸡包涵体肝炎、小鹅瘟等的诊断。

3）血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验。某些病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）。当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。此方法可用于禽流感、新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、鸡痘、鸡毒支原体病等的诊断。

4）补体结合试验。可溶性抗原与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可结合补体，但这一反应肉眼无法观察到，而通过加入溶血系统作指示系统，通过观察是否出现溶血，来判断反应系统是否存在相应的抗原抗体，该过程称补体结合试验。参与补体结合的抗体称补体结合抗体。此方法主要用于禽衣原体病的诊断。

5）病毒中和试验。中和试验在家禽病毒病的诊断工作中，常用于用已知病毒来检查未知血清，也可用已知血清来鉴定未知病毒，还可用于中和抗体的效价测定，其原理：病毒（抗原）与相应的抗体中和以后，可知病毒丧失感染力，该反应具有高度的种、型特异性，而且一定量的病毒必须有相应量的中和抗体才能被中和。此方法主要用于禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡痘、网状内皮增生症、番鸭细小病毒病的诊断。

6）免疫检测技术。利用某些能够通过某种理化因素易于检测的物质标记抗体，这些被标记的抗体与相应的抗原相结合，通过对标记物的测定，从而为抗原定性或定量。该技术目前广泛应用的主要有：免疫荧光技术、免疫酶标技术、聚合酶链反应技术等。这些方法已用于多种禽病的检测与诊断，如禽流感、新城疫、产蛋下降综合征、网状内皮增生症、传染性脑脊髓炎、病毒性关节炎、传染性鼻炎、小鹅瘟、鸭传染性浆膜炎、鸡毒支原体病、衣原体病等。