基于宏基因组测序对奶牛运动场土壤和粪便微生物群落结构的分析

胡 平

北京农业职业学院，北京 房山102442

奶牛运动场地面土壤潮湿，粪便、尿液以及运动场冲洗用水等污染物会渗入土壤并随冲洗水、雨水等冲刷扩散至周围环境中。奶牛粪便中携带的微生物种类丰富，对畜禽健康和养殖场周围环境都存在重要威胁[1]。近年来，在细菌群落结构分析中逐渐使用高通量测序技术[2-3]，但对奶牛场土壤和粪便环境中全面的微生物群落的研究还鲜见报道。本研究基于宏基因组测序技术对北京市某区奶牛养殖场土壤和粪便样本的微生物群落结构进行研究[4-5]，旨在为探究奶牛养殖场土壤环境中微生物污染情况提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

试验样本于2019 年5 月采集自北京市某区规模化奶牛场，采集17 份样本。其中，奶牛运动场围栏外2 m 位置土壤采集4 份（CB2M-1、CB2M-2、CB2M-3、CB2M-4）；运动场围栏外0.5 m 位置土壤 采 集5 份（CBH-1、CBH-2、CBH-3、CBH-4、CBH-5）；运动场内中心位置土壤采集4 份（CTN-1、CTN-2、CTN-3、CTN-4）；运动场内新鲜粪便样本4份（FB-1、FB-2、FB-3、FB-4）。以上土壤样本均采集距地表0～20 cm 深度的松软土壤，采用灭菌铲子取样，封装于灭菌样本管中。粪便样本均无菌采集自新鲜粪便中心位置，用无菌采样管收集封装（表1）。所有样本在干冰冰盒保存下迅速运送至实验室-80 ℃冰箱中保存待检。

表1 样本采集信息

1.2 总基因组DNA 提取

将在-80 ℃冰箱中保存的土壤及粪便样本，按照PowerSoil DNA Isolation Kit （MoBio Laboratories，Carlsbad，CA） 试剂盒说明书进行微生物组DNA 提取。

将提取到的DNA 用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度法检测DNA 质量和浓度，质检合格的样本存贮在-80 ℃冰箱中备用。

1.3 文库构建与测序

将质检合格的DNA 样品用Covaris 超声波破碎仪将基因组DNA 随机打断成长度约300 bp 的小片段，经末端修复、加A 尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成文库制备。先使用Qubit 初步定量构建完成的文库，并将文库浓度稀释至2 ng/μL。然后使用Agilent 2100 检测文库的插入片段，插入片段符合预期后使用Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞3 nmol/L）。最后把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行pooling，在Illumina HiSeq4000 平台进行测序。

1.4 数据分析处理

对原始数据使用Trimmomatic 软件进行系列质控，过滤并去掉质控后片段长度＜50 bp 的reads。将质控后得到的高质量序列clean reads 使用DIAMOND BLASTX 算法进行比对和物种注释。随后使用组装软件MEGAHIT（v1.0.6）对测序数据进行组装，并过滤掉组装结果中500 bp 以下的片段。采用prodigal 软件对组装得到的contig 序列进行ORF（Open Reading Frame）预测，使用CD-HIT软件对预测的结果去冗余，从而得到非冗余基因集。采用Bowtie 软件将测序数据与构建的非冗余基因集进行比对，并统计单个基因在不同样本的丰度信息。将预测得到非冗余基因集与功能注释数据库nr、Swiss-Prot、Kegg、Cog/Kog、eggNOG、GO、Pfam、ARDB/CARD、CAZyme 进行比对和注释。

2 结果与分析

2.1 基于基因丰度及物种注释丰度的PCA

基于基因丰度的PCA 分析（Principal Component Analysis）显示每个采样地内样本之间重复较好，其基因丰度的组成较为相近。其中CB2M 组与CBH 组在基因丰度组成上较为相似，而与CTN 和FB 组有显著差异（图1）。在基于物种丰度的PCA分析结果显示，除了CTN 组有1 个样本离散之外，CB2M 组、CBH 组以及CTN 组这3 个样本组在物种丰度组成方面较为相似，而他们与FB 组在物种丰度组成上有显著差异（图2）。

2.2 微生物群落结构

1）细菌群落组成。本项研究采取的4 组样本中细菌群落在门水平组成上有显著差异，其中CB2M、CBH 组样本细菌群落组成较相似，占比最高的是变形菌门（Proteobacteria，42.06%～44.01%）和放线菌门（Actinobacteria，18.42%～22.26%），其次依次是拟杆菌门（Bacteroidetes，6.63%～6.70%）、绿湾菌门（Chloroflexi，3.44%～4.26%）、浮霉菌门（Planctomycetes，3.40%～4.57%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，3.82%～4.17%）、酸杆菌门（Acidobacteria，3.57%～4.53%）、厚壁菌门（Firmicutes，2.53%～2.70%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，2.39%～2.53%；Cyanobacteria，2.02%～2.18%）。CTN 组样本中变形菌门比例显著高于CB2M 和CBH 组，而放线菌门比例小于CB2M 和CBH。在FB 样本中占比最高的是厚壁菌门和拟杆菌门，并且占比远高于在其他3 组中的比例（图3）。

在属水平的细菌组成中，CB2M、CBH 和CTN组样本细菌群落中丰度由高到低分别为：链霉菌属（Streptomyces）＞硝铵醇单胞菌属（Sphingomonas）＞诺卡氏菌属（Nocardioides）。FB 样本细菌组成丰度由高到低分别为：拟杆菌门（Bacteroides）＞梭菌属（Clostridium）＞瘤胃球菌属（Ruminococcus）＞另枝菌属（Alistipes）＞普氏菌属（Prevotella）等（图4）。

2）真菌群落组成。如图5 所示，CB2M、CBH 2 组样本的真菌群落组成差异不显著，其中子囊菌门（Ascomycota）占比78.71%～82.84%；担子菌门（Basidiomycota） 占比9.31%～13.59%；毛霉门（Mucoromycota）占比4.83%～5.08%；壶菌门（Chytridiomycota）占比1.53%～1.64%。CTN 样本中子囊菌门占比（95.46%）显著高于在CB2M（82.84%）和CBH（78.72%）中的占比。而FB 样本中子囊菌门占比（47.55%）低于上述3 组，担子菌门（19.78%）、毛霉门（17.87%）和壶菌门（11.84%）占比则高于上述3 组。

在属水平层面，4 组样本的真菌群落组成方面均有显著差异，CB2M 中比例较高的依次是马杜拉分支菌属（Madurella，13.80%）和镰刀菌属（Fusarium，9.24%）；CBH 样本中比例较高的是柄孢壳菌属（Podospora，8.47%）、镰刀菌属7.87%、毛壳菌属（Chaetomium，6.53%） 和马杜拉分支菌属4.60%；CTN 样本中分别是链格孢属（Alternaria，26.19%）、镰刀菌属26.08%、曲霉菌属（Aspergillus，11.79%）以及毛壳菌属（Chaetomium，6.04%）；FB 样本中毛霉菌属（Mucor，7.30%）、Rhizophagus，5.00%（图6）。

3）古菌群落组成。由图7 可知，4 个样本组在门水平上，奇古菌门（Thaumarchaeota）在CB2M、CBH和CTN 样本中比例依次升高，分别为46.62%、51.58%、64.88%，而在FB 样本中只有不到1%。广古菌门（Euryarchaeota）在CB2M、CBH 和CTN 样本中比例依次降低，分别为43.94%、37.59%、27.48%，而在FB 中占比达到了96.14%。

在属水平上如图8 所示，CB2M、CBH 和CTN组主要古菌为亚硝化球菌属（Nitrososphaera）（33.11%、37.56%、55.77%）和氨氧化古菌Candidatus_Nitrosocosmicus（17.83%、19.50%、13.22%）以及一定比例的甲烷囊菌属（Methanoculleus）（6.42%、1.47%、1.19%）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）（4.64%、4.10%、2.39%），而粪便样本中绝对优势菌为甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）（66.34%），其次是甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）（3.34%）。

3 讨 论

3.1 细菌群落分析

在细菌门水平组成上，运动场围栏外2 m（CB2M）、0.5 m（CBH）和运动场中央（CTN）土壤的样本中可见丰度最高的是变形菌门，其次是放线菌门，其余依次为拟杆菌门＞绿湾菌门＞浮霉菌门＞芽单胞菌门＞酸杆菌门＞厚壁菌门＞、疣微菌门＞蓝细菌门。且以运动场中央为圆心，距离越远的样本变形菌门丰度逐渐下降，而放线菌门丰度逐渐增加。有报道称变形菌门是奶牛场养殖用水样本中的类群，说明变形菌门在运动场中央粪便和尿液丰富的湿润土壤环境中更易生长和繁殖，该结果与闫艳华等[6]的相关研究报道基本一致。在粪便样本（FB）中占比最高的是厚壁菌门和拟杆菌门，这与其他学者的报道[7-8]相似。

在细菌属水平物种组成中，链霉菌属丰度最高，其次是硝铵醇单胞菌属、诺卡氏菌属。FB 样本细菌组成丰度由高到低依次是拟杆菌属、梭菌属、瘤胃球菌属、另枝菌属和普雷沃菌属等。其中，围栏外2.0 m 和0.5 m 组样本细菌群落组成相似，链霉菌属、鞘氨醇单胞菌属和诺卡氏菌属比例显著高于运动场中央土壤和粪便样本。硝铵醇单胞菌属、普雷沃菌属、梭菌属等均为常见的机会性致病菌，对奶牛场养殖环境控制均具有临床意义[9-10]。

3.2 真菌群落分析

宏基因组技术不依赖于微生物的分离培养，克服了传统纯培养方法的技术限制，为可培养的微生物提供了一种新的途径。本项研究运用宏基因组学技术对奶牛运动场中心及周围土壤和粪便中的真菌进行了物种分析，结果显示运动场围栏外2 m 和0.5 m 及运动场中央土壤中门水平上丰度占绝对优势的真菌为子囊菌门，而在运动场中央土壤子囊菌门的占比显著高于围栏外2 组。在粪便样本中丰度最高的真菌为子囊菌门、担子菌门、毛霉菌门和壶菌门。造成奶牛真菌性乳房炎的多种酵母样真菌都属于子囊菌门[11]，有研究[12]报道，担子菌门和芽枝霉门在发生犊牛腹泻的粪便样本中显著高于健康犊牛。担子菌门是草食动物粪便中丰度最高的粪栖真菌，这与杨顼等[13]的相关报道一致。在属水平上，运动场外2 m 土壤中真菌占比由高至低为马杜拉菌属和镰孢属；运动场外0.5 m 的土壤中占比最高的是柄孢壳菌属、链胞菌属、毛霉菌属和马杜拉菌属；在运动场中央丰度最高的是链格孢属和镰孢属，其次是曲霉菌属和毛壳菌属。在粪便样本中主要是毛霉菌属和Rhiaophagus。

3.3 古菌群落分析

3 个土壤样本中奇古菌门的丰度随着距离向运动场中央靠近逐渐增加，而广古菌门丰度逐渐减少。在属水平上3 个土壤样本中主要为亚硝化球菌属、氨氧化古菌、甲烷囊菌属和甲烷八叠球菌属。在粪便样本中广古菌门占绝对优势96.14%，其中绝对优势菌为甲烷短杆菌，其次是甲烷八叠球菌属，这与奶牛消化道大量产甲烷菌密切相关，与相关报道一致。

4 结 论

本项研究通过宏基因组技术对奶牛养殖场运动场内、运动场周边土壤进行了微生物群落分析，同时对新鲜奶牛粪便也进行了微生物群落分析。研究发现变形菌门、放线菌门是土壤中的优势细菌，子囊菌门和担子菌门为土壤中的优势真菌，奇古菌门和广古菌门为优势古菌群落。在新鲜粪便中的优势细菌为厚壁菌门和拟杆菌门，而担子菌门、毛霉门和壶菌门为优势真菌群落。在这些优势群落中大多数微生物都具有机会致病菌特点，往往与奶牛乳房炎、犊牛腹泻、腐蹄病和皮肤病等相关，因此控制奶牛场内土壤和粪便中的微生物污染是规模化奶牛场需要严格规范管理的方向。