党参低聚糖脱色纯化工艺优化及其抗氧化活性研究

樊精敏， 白瑞斌， 王燕萍， 王子夏， 胡芳弟*

(1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省党参产业技术工程研究中心，甘肃 兰州 730000)

低聚糖是党参主要活性成分，具有抗氧化[1]、耐缺氧[2]、免疫调节[3]等药理作用，但它是通过粗提得到，含有大量有色杂质而呈深棕色，严重影响其含量测定和活性评价。文献[4]报道，低聚糖纯化后抗氧化作用显著提升，故本实验对粗提党参低聚糖进行脱色纯化处理。

大孔吸附树脂对天然产物中生物活性成分的脱色具有重要意义[5]，可采用静态吸附直接过滤法同时实现脱色和纯化目的，而且具有较高的效率[6]，但目前尚无关于党参低聚糖纯化工艺的报道。因此，本实验采用大孔吸附树脂对党参低聚糖进行脱色纯化，响应面法优化工艺，同时评价该成分抗氧化活性，以期为其进一步开发利用提供基础。

1 材料

旋转蒸发仪、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；FA2004电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；真空冷冻干燥机(宁波鲍斯能源装备股份有限公司)；UV-1700紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；TS-2000A脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制备有限公司)。

党参来源于甘肃省文县，经兰州大学药学院周印锁教授鉴定为正品，按照文献[7]报道制备低聚糖，方法为药材粉碎后过2号筛，精密称取5 g，加入10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次1 h，弃去滤液，滤渣晾至无醇味，加入10倍量水煎煮3次，每次45 min，合并滤液，浓缩至原体积的1/4，缓慢加入95%乙醇至终体积分数为80%，静置过夜后离心，10 600×g离心15 min，收集上清液，在温度50 ℃、转速60 r/min条件下减压浓缩回收乙醇，蒸干，冷冻干燥至恒重，即得。

葡萄糖对照品(批号110833-201205，中国食品药品检定研究院)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海源叶生物科技有限公司)。DM-28、DM-21、AB-8大孔吸附树脂[艾美科健(中国)生物医药有限公司]。无水乙醇(日本Sigma公司)；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 树脂筛选 根据文献[8]报道，本实验选择AB-8、DM-21、DM-28型，三者均为聚苯乙烯型非极性吸附树脂，吸附机理为疏水性吸附，而且比表面积和孔径较大，适合吸附中药中的疏水性成分。

2.1.1 预处理 精密称取3种树脂各5 g，分别用蒸馏水、95%乙醇清洗，最后用蒸馏水洗脱残留的乙醇。为了进一步除去其他杂质，将树脂依次用5%氢氧化钠、5%盐酸处理，最后用去离子水洗至中性。

2.1.2 脱色纯化效率测定 将预处理好的3种树脂与50 mL低聚糖溶液(10 mg/mL)一同加入150 mL锥形瓶中，振摇至吸附平衡，过滤收集液体，在温度50 ℃、转速60 r/min条件下减压浓缩，蒸干，冷冻干燥至恒重，计算低聚糖脱色率、回收率，公式分别为脱色率=[(A0-A1)/A0]×100%(A0、A1分别为脱色前后低聚糖溶液在420 nm波长处的吸光度)、回收率=(C1/C0)×100%(C0、C1分别为脱色前后低聚糖含量[9])。再将脱色率、回收率权重分别设定为60%、40%，计算综合评分，公式为综合评分=(脱色率/脱色率最大值)×100×60%+(回收率/回收率最大值)×100×40%。

2.2 单因素试验 按“2.1.2”项下方法处理，固定低聚糖质量浓度为10 mg/mL，体积为50 mL，考察不同脱色时间(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、树脂用量(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 g)对低聚糖脱色纯化效果的影响，各平行3份。

2.3 响应面法 根据单因素试验结果，设计三因素三水平响应面试验，按“2.1.2”项下方法处理，以脱色时间(A)、pH(B)、树脂用量(C)为影响因素，脱色率、回收率的综合评分(Y)为评价指标，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.4 低聚糖含量测定 将经脱色纯化的低聚糖溶液冷冻干燥，采用苯酚-硫酸法测定其含量。

3 结果

3.1 树脂筛选 如表2所示，各树脂脱色纯化效果依次为DM-28型>DM-21型>AB-8型，故选择DM-28型作进一步研究。

表2 3种树脂脱色纯化效果比较

3.2 单因素试验

3.2.1 脱色时间 固定pH为4，树脂用量为2 g。如图1所示，随着脱色时间延长，色素分子逐渐扩散出来，低聚糖脱色率先升高后无明显变化；脱色0.5～1 h时，由于树脂对低聚糖的吸附逐渐增多，导致后者回收率急剧降低；脱色1～4 h时，低聚糖回收率先升高后逐渐降低，在2 h时综合评分最高。因此，确定最佳脱色时间为2 h。

3.2.2 pH 固定脱色时间为2 h，树脂用量为2 g。如图2所示，pH 3～4时，脱色率无明显变化，回收率逐渐升高；pH 4～7时，脱色率、回收率均逐渐降低，在pH 4时综合评分最高。因此，确定最佳pH为4。

3.2.3 树脂用量 固定脱色时间为2 h，pH为4。如图3所示，随着树脂用量增加，吸附量逐渐大于扩散出来的色素分子，脱色率先升高后无明显变化，回收率逐渐降低，在2 g时综合评分最高。因此，确定最佳树脂用量为2 g。

表3 试验设计与结果

表4 方差分析

响应面分析见图4。由此可知，与pH比较，脱色时间效应面更陡，表明脱色时间对脱色纯化效果的影响程度高于pH；与脱色时间比较，树脂用量效应面更陡，表明树脂用量对脱色纯化效果的影响程度高于脱色时间；与pH比较，树脂用量效应面更陡，表明树脂用量对脱色纯化效果的影响程度高于pH，结合等高线图形状，各因素影响程度依次为树脂用量>脱色时间>pH。

最终确定，最优工艺为脱色时间2.29 h，pH 4.72，树脂用量3.18 g，根据实际情况，将其修正为脱色时间2.3 h，pH 4.7，树脂用量3.2 g，脱色率为94.76%，回收率为88.91%，综合评分为92.42分，与预测值92.97分接近，表明模型拟合度较好，可用于工艺优化。

3.4 低聚糖含量测定 如图5所示，脱色前后低聚糖含量分别为(56.60±1.51)%、(83.96±2.07)%，差异有统计学意义(P<0.01)，表明该成分纯度显著提高。

3.5 DPPH自由基清除实验 如图6所示，脱色前后低聚糖(1.25 mg/mL)对DPPH自由基的清除率分别为(59.52±2.11)%、(81.27±2.47)%，差异有统计学意义(P<0.01)，表明该成分DPPH自由基清除活性显著提高。

3.6 羟自由基清除实验 如图7所示，脱色前后低聚糖(2.5 mg/mL)对羟自由基的清除率分别为(11.44±0.33)%、(17.94±0.30)%，差异有统计学意义(P<0.01)，表明该成分羟自由基清除活性显著提高。

4 讨论与结论

大多数天然来源的低聚糖含有很多色素，导致其颜色较深，严重制约定性定量、分离纯化、药理活性方面的研究[11]，故脱色是该成分制备过程中需要解决的关键问题。目前，常见的脱色方法有H2O2、活性炭、大孔吸附树脂脱色等[12]，其中H2O2通过氧化色素达到脱色目的，但其较强的氧化性可能使低聚糖氧化分解加重，导致其损失增加[13]；活性炭粒度对脱色效果影响较大，太小时脱色后滤除困难[6]，而且它对水提得到的低聚糖脱色效果不理想[14]；大孔吸附树脂通过选择吸附性和筛分性去除低聚糖中色素，有很好的脱色效果[15]。

综上所述，本实验采用大孔吸附树脂，通过静态吸附直接过滤法对党参低聚糖进行脱色纯化，确定了最优工艺，发现该成分纯度及抗氧化活性均显著增加，可在一定程度上改善其品质，为后续相关研究提供了基础。