绞股蓝总皂苷对3T3-L1前脂肪细胞棕色化和自噬活性的影响

陈 超， 黄 平， 林若冰， 范雪敏， 余 绮， 傅丹青*

(1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第二医院，浙江 杭州 310005；3.浙江药科职业大学，浙江 宁波 315153)

绞股蓝总皂苷是对从绞股蓝中提取出80余种皂苷的总称，是绞股蓝中活性较强的成分，也是发挥降血脂作用的主要活性成分。绞股蓝又名五叶参、七叶胆、天堂草，为葫芦科绞股蓝属多年生草质攀援植物，因其卷曲茎蔓缠绞攀缘而生，其叶似小蓝叶，故名“绞股蓝”。绞股蓝在古籍中的记载最早可以追溯到《救荒本草》，该书不仅在本草救荒方面起到极大作用，还开创了我国野生植物研究与利用的历史，由此绞股蓝开始逐渐为人们熟知及应用[1]。绞股蓝中含有绞股蓝总皂苷、绞股蓝黄酮、绞股蓝多糖等多种活性成分，其中绞股蓝总皂苷含量最高，可溶于水、乙醇和氯仿中，具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化等药理作用[2-5]。目前，对于绞股蓝总皂苷降血脂方面的相关研究仍未深入探索，其作用机制尚未明确，因此本研究通过建立体外脂肪细胞模型，探讨绞股蓝总皂苷对促进3T3-L1前脂肪细胞棕色化和抑制自噬活性的影响，以期为绞股蓝总皂苷进一步的开发和利用提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株 3T3-L1前脂肪细胞株购自美国ATCC公司。

1.2 试剂与药物 绞股蓝总皂苷(货号FY1362，纯度98%)购自南通飞宇生物科技有限公司。DMEM高糖培养基(货号C11995500BT)购自美国Gibco公司；地塞米松(货号D4902)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(货号I7018)、油红O染液(货号O0625)均购自美国Sigma公司；胰岛素购自丹麦诺和诺德公司；CCK8试剂盒(货号BS350B)购自合肥白鲨生物科技有限公司；鼠源Total OXPHOS Rodent抗体(货号ab110414)、兔源UCP1抗体(货号ab209483)、兔源PGC-1α抗体(货号ab54481)均购自英国Abcam公司；兔源SQSTM1/P62抗体(货号5114)、兔源Beclin-1抗体(货号3495)、兔源LC3A/B抗体(货号12741)、兔源α-Tubulin抗体(货号2144)、兔抗HRP标记二抗(货号7074)、鼠抗HRP标记二抗(货号7076)均购自美国CST公司。

1.3 仪器 超低温冰箱、微量离心机、生物安全柜、二氧化碳培养箱、微量核酸蛋白分析仪、NanoDrop One酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；高速离心机、梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；倒置显微镜[麦克奥迪(厦门)医疗诊断系统有限公司]；荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；蛋白扫膜仪(美国ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化 将3T3-L1前脂肪细胞按照每孔3×104/mL的密度接种于6孔板中，待其生长至接触抑制状态(即达到100%融合)后继续培养48 h(第0天)，吸弃孔中液体，加入2 mL诱导培养基Ⅰ(含1 μg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培养基)，继续培养72 h(第3天)，吸弃孔中液体，加入2 mL诱导培养基Ⅱ(含1 μg/mL胰岛素的DMEM高糖培养基)，继续培养48 h(第5天)，吸弃孔中液体，加入2 mL DMEM高糖培养基继续培养，于第8～12天，每隔2 d更换培养液，直至超过85%的细胞分化为成熟脂肪细胞(大量脂滴形成)，即可进行后续实验。

2.2 油红O染色法鉴定成熟脂肪细胞 取“2.1”项下培养的成熟脂肪细胞，吸弃孔中液体，PBS漂洗3次，每孔加入2 mL 10%多聚甲醛，室温固定30 min，吸弃孔中液体，PBS漂洗3次，每孔加入2 mL经稀释的油红O储存液，避光染色1 h，弃油红O储存液，PBS漂洗3次，于倒置显微镜下观察并拍照。

2.3 CCK8法筛选绞股蓝总皂苷的干预剂量 3T3-L1前脂肪细胞按“2.1”项下方法培养，在实现细胞诱导分化成熟后，弃去原有的培养基，加入含有不同质量浓度绞股蓝总皂苷(0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、200 μg/mL)的DMEM高糖培养基，干预48 h后，加入 CCK8溶液后于细胞培养箱中继续培养2 h，采用酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度，通过与对照组(0 μg/mL绞股蓝总皂苷)比较，计算各组细胞存活率。

2.4 实验分组 根据CCK8法筛选绞股蓝总皂苷干预剂量结果，分别设置对照组(0 μg/mL)和绞股蓝总皂苷低、中、高剂量组(0.1、1、10 μg/mL)。

2.5 Western blot法检测棕色脂肪产热相关蛋白、线粒体及自噬相关蛋白的表达 3T3-L1前脂肪细胞按“2.1”项下方法诱导分化成熟后，按“2.4”项下分组进行干预，48 h后收集细胞。细胞裂解提取总蛋白，BCA法定量后加入蛋白上样缓冲液，95 ℃加热10 min进行变性，蛋白样本经电泳、转膜、封闭后，加入一抗UCP1(1∶2 000)、PGC-1α(1∶1 000)、Total OXPHOS Rodent(1∶250)、LC3(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、SQSTM1/P62(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育1 h，ECL化学发光显色法显影，使用Image J软件进行灰度值分析，以目的蛋白与α-Tubulin的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2.6 RT-qPCR检测棕色脂肪特异性基因、产热基因及线粒体相关基因的mRNA表达 3T3-L1前脂肪细胞按“2.1”项下方法诱导分化成熟后，按“2.4”项下分组进行干预，48 h后收集细胞，提取细胞总RNA，测定RNA的浓度，用逆转录试剂盒合成cDNA，随后进行PCR扩增，循环40次，根据PCR扩增所得各组的目的基因和内参基因的CT值，以2-ΔΔCT法计算目的基因Cidea、Dio2、Cox2、Cox8b的相对表达。引物序列见表1。

3 结果

3.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成熟的鉴定 3T3-L1前脂肪细胞未经诱导分化时呈梭形或多边形，而经过诱导分化之后，可以观察到细胞的体积逐渐增大，形状逐渐变圆，细胞内脂滴不断形成，并呈现逐渐增大的趋势。油红O染色结果显示，分化成熟的3T3-L1细胞内脂滴能被特异性染成明亮的红色，而未分化成熟的细胞内非脂质成分则不被染色，见图1。

3.2 绞股蓝总皂苷干预剂量的筛选 与对照组比较，绞股蓝总皂苷质量浓度大于10 μg/mL时，细胞存活率降低(P<0.01)，故选择对细胞活力无影响的最大质量浓度1 μg/mL为中剂量，0.1、10 μg/mL为低、高剂量进行后续实验，见图2。

3.3 绞股蓝总皂苷对3T3-L1前脂肪细胞棕色脂肪产热相关蛋白表达的影响 与对照组比较，绞股蓝总皂苷各剂量组UCP1、PGC-1α蛋白表达升高(P<0.01)，见图3。

3.4 绞股蓝总皂苷对3T3-L1前脂肪细胞线粒体相关蛋白表达的影响 与对照组比较，绞股蓝总皂苷各剂量组Complex Ⅰ、Ⅱ蛋白表达均升高(P<0.01)，Complex Ⅳ蛋白表达均降低(P<0.05，P<0.01),Complex Ⅲ蛋白表达无明显变化(P>0.05)；绞股蓝总皂苷低、高剂量组Complex Ⅴ蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)，见图4。

3.5 绞股-蓝总皂苷对3T3-L1前脂肪细胞自噬相关蛋白表达的影响 与对照组比较，绞股蓝总皂苷各剂量组SQSTM1/P62蛋白表达均升高(P<0.01)；绞股蓝总皂苷低剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达升高(P<0.01)，中、高剂量组则降低(P<0.01)；绞股蓝总皂苷低、高剂量组Beclin-1蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，见图5。

3.6 绞股蓝总皂苷对3T3-L1前脂肪细胞Cidea、Dio2、Cox2、Cox8bmRNA表达的影响 与对照组比较，绞股蓝总皂苷各剂量组Cidea、Cox2、Cox8bmRNA表达升高(P<0.01)，绞股蓝总皂苷高剂量组Dio2 mRNA表达升高(P<0.01)，见图6。

4 讨论

目前认为，肥胖症的发生主要与机体摄入过多能量引起脂肪过度堆积相关，是一种能量代谢平衡紊乱的代谢性综合征[6]。棕色脂肪组织减少以及白色脂肪组织堆积是肥胖症的发病机制之一[7]。白色脂肪组织主要分布在皮下和内脏周围，将机体内过剩的能量通过白色脂肪的形式进行贮存[8]。棕色脂肪组织主要分布在颈部、锁骨上区、椎旁等，消耗能量以产生热量[9]。有研究表明，脂肪组织并非是静止的状态，而是处于一种动态转化的过程[10-11]。白色脂肪组织在一定的刺激下向棕色脂肪组织发生转变，白色脂肪细胞内单泡脂滴体积减小、数量增加，UCP1和PGC-1α呈现高表达，从而使能量消耗增加，这一过程被称为白色脂肪棕色化，并且以存在较多的线粒体为特征[12]。

线粒体是细胞进行氧化代谢活动、制造并释放能量的单元，并且它还是细胞内最大的铁代谢场所，正是由于富含线粒体，使得棕色脂肪呈现棕色样改变[13]。线粒体氧化磷酸化的电子传递链，亦称线粒体呼吸链，其主要分布在线粒体的内膜上，并由跨膜蛋白复合体(线粒体呼吸链膜蛋白复合体ComplexⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、位于Complex Ⅰ/Ⅱ与Ⅲ之间的泛醌以及位于Complex Ⅲ与Ⅳ之间的细胞色素共同构成[14]。在线粒体氧化磷酸化的过程中，Complex Ⅰ、Ⅱ扮演着门控的角色，是电子进入线粒体电子传递链的主要单元，还起到将电子传递给Complex Ⅲ、Ⅳ的作用；Complex Ⅲ作为泛素-细胞色素C氧化还原酶，是线粒体发生氧化磷酸化这一生物过程的必要元素；Complex Ⅳ作为线粒体电子传递链的终端电子受体，同时又是细胞色素C氧化酶，能够对细胞色素C进行催化氧化，将O2转变为H2O；Complex Ⅴ协同上述4种复合物参与完成线粒体氧化磷酸化的最终环节，并产生ATP，被称为ATP合成酶。当线粒体数量增多时，可以观察到Complex Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表达升高。

在肥胖症中，白色脂肪组织的自噬被过度激活，机体从自身脂肪组织中回收能量，并利用该能量产生更多的脂肪，抑制自噬可以促进白色脂肪棕色化，减少白色脂肪组织的堆积，从而延缓肥胖症的进展[15-17]，自噬活性受到抑制时往往伴随着Beclin-1和LC3表达的降低和SQSTM1/P62表达的升高[18-20]。

本研究发现，绞股蓝总皂苷可以通过提高棕色脂肪产热相关蛋白UCP1、PGC-1α，线粒体相关蛋白Complex Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ表达以及棕色脂肪特异性基因Cidea、棕色脂肪产热基因Dio2、线粒体相关基因Cox2和Cox8bmRNA表达，从而促进3T3-L1前脂肪细胞棕色化。绞股蓝总皂苷还可通过降低自噬相关蛋白Complex Ⅳ、LC3、Beclin-1蛋白表达以及提高SQSTM1/P62蛋白表达抑制3T3-L1前脂肪细胞的自噬活性，且作用阈值可能为低质量浓度，后续将进一步调整剂量进行研究。

综上所述，绞股蓝总皂苷可以促进3T3-L1前脂肪细胞棕色化并抑制其自噬活性，可为其进一步的开发和利用提供实验依据。