大豆籽粒低聚糖及其组分含量鉴定与特异种质筛选

李俊茹，秦 宁，李文龙，杜 汇，李喜焕，张彩英

(河北农业大学 / 华北作物改良与调控国家重点实验室，河北保定 071001)

0 引 言

【研究意义】大豆低聚糖是其可溶性糖含量总称，一般包括蔗糖、棉籽糖、水苏糖等，分别占其籽粒干基含量5%、1%和4%(合计约占8%～10%)[1-6]。大豆低聚糖具有促进营养物质吸收等多种功能[7-11]。低聚糖还可作为一种低甜度、低热量的甜味剂替代食品加工中的蔗糖。低聚糖所具有的抗淀粉氧化功能还可用于延长食品贮藏期限。【前人研究进展】宋志峰等[12]利用高效液相色谱方法，测定来自吉林省的500份大豆品种资源低聚糖含量，结果表明，籽粒低聚糖含量分布在7.73%～13.46%，其中超过12%的品种有49个，蔗糖含量分布在3.42%～8.27%，棉籽糖含量分布在0.41%～1.37%，水苏糖含量为3.23%～4.87%。王晓岩等[13]通过分析大豆近等基因系材料在不同生态环境条件下的低聚糖及其组分含量，发现不同环境条件下的供试大豆材料籽粒低聚糖含量存在一定差异，其中在2种环境条件下均表现较优的材料有10个。王曙明等[14]分析吉林省181份大豆资源低聚糖含量发现，低聚糖、棉籽糖和水苏糖含量变异范围为2.6%～6.7%、0.3%～1.8%和2.1%～5.1%；Yoshikawa等[15]研究15个纳豆品种(包括3个优质、9个中等、3个劣质品种)籽粒低聚糖含量发现，优质纳豆资源的低聚糖含量显著高于其它品种；王跃强等[16]利用美国大豆V97-3000与V99-5089构建的分离群体，经测定其籽粒低聚糖含量发现，供试材料间存在较大差异。Kerr和Neus[17-18]通过测定美国大豆种质资源低聚糖含量，筛选出2份高蔗糖、低水苏糖特异种质，其蔗糖含量分别可达9.4%和11.2%，而水苏糖含量为0.64%和0.14%。【本研究切入点】尽管目前有少数关于吉林及国外大豆籽粒低聚糖含量测定及优异资源筛选研究报道，但筛选出的种质资源远不能满足育种和生产需求。需研究大豆低聚糖及组分含量遗传变异及其相关关系。【拟解决的关键问题】利用336份来自于不同省份及不同类型的大豆品种资源，采用高效液相色谱技术鉴定其籽粒低聚糖及其组分含量，研究其遗传变异及其相关关系，并遴选低聚糖及其组分含量特异种质，为大豆低聚糖含量遗传改良奠定物质基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

以336份东北生态区大豆资源为材料，包括农家品种和育成品种(系)，由中国农业科学院作物科学研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

供试材料于2019年种植于河北农业大学作物育种中心(河北保定)，行长1.5 m，行距0.5 m，随机区组设计，2次重复。

1.2.2 低聚糖组分标准样品配制及其线性方程

准确称取蔗糖、棉籽糖和水苏糖标准品各250 mg，10 mL超纯水溶解，并用乙腈定容至25 mL，配制成10 g/L标准品储备液[19]；分别从储备液中精确移取一定数量标准溶液，置于10 mL容量瓶，定容后形成标样；制备标准样品进行低聚糖及其组分含量测定，制作线性方程，计算其决定系数，用于供试资源低聚糖含量测定。表1

表1 低聚糖组分线性回归方程及其决定系数Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient of oligosaccharides

1.2.3 大豆样品的制备

大豆低聚糖含量测定方法基本流程如下[20-24]：利用研磨机将供试大豆品种资源籽粒研磨粉碎，过60目筛；称取0.1 g上述豆粉(精确到0.000 1 g)，加入1.5 mL乙醇(75%色谱纯)溶解振荡15 s，超声浸提1 h(40 Hz，60℃)；于超声浸提后4 000 r/min离心10 min，吸取上清，过0.22 μm微孔滤膜；将滤液置于样品瓶，经液相色谱方法测定其蔗糖、棉籽糖、水苏糖及其低聚糖含量。

选择65∶35、70∶30、75∶25 3种组合进行单因子试验，在其它条件一定的情况下，比较不同比例流动相条件，大豆籽粒中蔗糖、棉籽糖、水苏糖的出峰时间及理论塔板数。

1.2.4 低聚糖测定高效液相色谱基本条件

色谱柱：岛津Inertsil氨基柱(规格为4.6×250 mm，5 μm)；流动相：超纯水30%：乙腈70%(流动相超声脱气30 min)；流速：1 mL/min；检测器：RID示差折光检测器；色谱柱温度：35℃；检测器温度：40℃；进样量：10 μL。

1.3 数据处理

试验数据描述统计、方差分析与聚类分析等采用SPSS21.0和Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 大豆低聚糖及组分含量测定方法建立

2.1.1 流动相的确定

研究表明，随着流动相中乙腈比例的增加，大豆低聚糖3种组分的出峰时间延长。流动相比例在75∶25和70∶30之间都有良好的柱效(理论塔板数大于6 000)，选择70∶30为流动相。表2

低聚糖3种组分能够很好的分离，且峰形较好，标准品出峰时间与样品一致，提取样品中的成分分别是蔗糖、棉籽糖、水苏糖。在保留时间够短，柱效较高的情况下，选用30∶70的流动相配比。图1，图2

2.1.2 低聚糖检测方法的可靠性检验

研究表明，同一大豆样品连续6次技术重复测定结果之间相差较小，数值接近，其相对标准偏差分别为0.53%(蔗糖)、1.72%(棉籽糖)和1.04%(水苏糖)，均未超出2%允许误差；重复间的数值非常接近，相对标准偏差分别为0.76%(蔗糖)、1.24%(棉籽糖)和0.98%(水苏糖)，也小于2%误差标准。表3，表4

表2 流动相比例Table 2 Results of different ratio of mobile phase’s experiment

图1 低聚糖组分标准品液相色谱图Fig.1 The oligosaccharide chromatogram of standard samples

图2 低聚糖组分大豆样品液相色谱图Fig.2 The oligosaccharide chromatogram of soybean samples

表3 大豆低聚糖组分含量测定方法的技术重复精密度Table 3 The precision analysis of soybean oligosaccharides methods on technical duplication

表4 大豆低聚糖组分含量测定方法的生物学重复精密度Table 4 The precision analysis of soybean oligosaccharides methods on biological duplication

2.2 大豆品种资源籽粒低聚糖及组分含量总体评价

研究表明，其籽粒蔗糖、棉籽糖、水苏糖、低聚糖平均含量分别为4.01%、1.16%、2.60%和7.77%，3种组分以蔗糖含量最高；同时发现，其变化范围分别为2.13%～6.26%、0.30%～2.00%、0.95%～3.87%及5.63%～11.13%，变异系数分别为15.21%、25.51%、19.16%与9.04%，以棉籽糖含量变异系数最大。有64.88%品种蔗糖含量分布在3.37%～4.47%，65.77%品种棉籽糖含量分布在0.81%～1.37%，57.44%品种水苏糖含量分布在2.22%～3.00%，77.68%品种低聚糖含量分布在6.91%～8.38%。表5，表6

表5 供试大豆品种资源籽粒低聚糖及组分含量遗传变异Table 5 The genetic variation of oligosaccharide and its component contents in soybean varieties

表6 供试大豆品种资源籽粒低聚糖及组分含量分布Table 6 The distribution of oligosaccharide and its component contents in soybean varieties

2.3 大豆籽粒低聚糖及组分间的相关性

研究表明，低聚糖含量与蔗糖、棉籽糖、水苏糖含量间存在极显著相关，并以低聚糖与蔗糖间的相关系数最高(0.721)，低聚糖与棉籽糖含量间的相关系数达0.513，蔗糖与棉籽糖间的相关系数达0.351，均达到极显著水平，而水苏糖与蔗糖、棉籽糖间则呈现极显著负相关(r=-0.415；r=-0.298)，协调水苏糖与其它组分间关系是实现大豆低聚糖含量改良的关键。表7

表7 供试大豆品种资源籽粒低聚糖及组分含量相关性Table 7 The correlation analysis of oligosaccharide and its component contents in soybean

2.4 大豆品种资源籽粒低聚糖及组分含量聚类

研究表明，在欧氏距离为15时，可将其划分为3类，其中第Ⅰ类属于低聚糖及其组分含量较高类型，包括吉林3号、大粒黄、青杂豆、黑河9号、合丰29、黑河1号、宝丰8号、疆丰23-3412和呼交282共9个品种，该类品种低聚糖含量平均可达10.08%，其中以呼交282低聚糖含量最高(11.13%)；第Ⅱ类包括323个品种，属于中间类型，其低聚糖含量平均为7.72%；第Ⅲ类属于低聚糖及其组分含量较低品种，包括黑秣食豆、黑秣豆、吉育105和哈12-4547共4个品种，其低聚糖含量平均为6.54%。表8

表8 供试大豆品种资源籽粒低聚糖及组分含量聚类Table 8 The cluster analysis of oligosaccharide and its component contents in soybean

2.5 大豆籽粒低聚糖及组分含量特异种质遴选

研究表明，筛选出不同类型高、低含量特异种质各5份，包括低聚糖高含量特异种质合丰29、疆丰23-3412、青杂豆、大粒黄和呼交282，其含量均在10%以上；蔗糖高含量特异种质吉林3号、呼交282、宝丰8号、大粒黄、青杂豆，其含量均在5.59%以上；棉籽糖高含量特异种质疆丰23-3412、毛豆、合丰44等，其含量均高于1.86%；水苏糖高含量种质黑秣豆(3.77%)和哈14-2146(3.87%)等。

筛选出低聚糖低含量特异种质宾县黑豆、哈12-4547、绥农1号等，其含量均在6.29%以下；蔗糖低含量特异种质哈12-4547、吉育105、黑秣豆等，其含量均在2.85%以下；棉籽糖低含量特异种质黑秣食豆、吉育105等，其含量均低于0.56%；水苏糖低含量特异种质绥无腥豆3号(0.95%)和合农69(1.08%)等。表9

3 讨 论

研究利用高效液相色谱方法对供试336份大豆品种资源籽粒低聚糖及其组分含量进行鉴定，结果发现，蔗糖、棉籽糖、水苏糖及低聚糖含量均值为4.01%、1.16%、2.60%和7.77%，与王晓岩[25]所测上述4种含量(4.56%、0.90%、3.39%、8.86%)、宋志峰等[12]所测4种含量(5.86%、1.01%、3.97%、10.84%)以及王晓岩等[13]所测Harosoy近等基因系在北京(4种含量4.493%、0.824%、3.243%、8.560%)和内蒙(4种含量5.663%、0.861%、3.398%、9.922%)两地结果相比，低聚糖含量均值稍低，而棉籽糖含量稍高，这与供试品种资源以及光周期等环境因素有一定关系。

表9 遴选出的大豆籽粒低聚糖及组分含量特异种质Table 9 The selected soybean germplasms of oligosaccharide and its component contents

基于供试336份大豆品种资源低聚糖及其组分含量具体表现，研究筛选出各种类型特异种质共40个，其中包括高含量种质20个、低含量种质20个，其中低聚糖含量最高的品种为呼交282，其低聚糖总含量达到11.13%(一般品种低聚糖含量在8%左右)，且蔗糖、棉籽糖、水苏糖含量也较高，可用于大豆籽粒低聚糖含量常规及分子遗传改良。通过分析供试大豆品种资源籽粒低聚糖及其组分间的相关性，结果发现，低聚糖与3种组分间均存在极显著正相关，蔗糖与棉籽糖之间也存在显著相关，这与王晓岩[25]研究结果基本一致。

4 结 论

在流动相比例70∶30(乙腈：水)的情况下，能达到高效稳定的分离目的；供试东北生态区大豆种质低聚糖及其含量存在丰富的遗传变异，具有较大的选择潜力；供试群体低聚糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖之间相关系数达到显著或极显著水平；东北生态区种质筛选出低聚糖含量各种类型特异种质共40个，其中包括高含量种质20个、低含量种质20个。