黄精多指标成分近红外光谱快速定量分析模型建立

2022-12-05吴杭莎韦飞扬葛卫红杜伟锋李昌煜张叶峰

中成药 2022年9期

吕悦，吴杭莎，韦飞扬，葛卫红*，杜伟锋,2,3*，李昌煜，张叶峰

(1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，浙江杭州 311401；3.浙江中医药大学中药饮片有限公司，浙江杭州 311400；4.浙江中医药大学中医药科学院，浙江杭州 310053；5.宁波市中药饮片有限公司，浙江宁波 315000)

黄精是我国应用历史悠久的传统名贵滋补中药[1]。黄精含有多糖、皂苷、黄酮、生物碱、木脂素[2-4]类化合物，其中多糖、皂苷类成分含量较高，为发挥药效作用的主要成分，有抗疲劳、抗氧化、降血糖血脂等作用[5-6]，可作为体现黄精饮片质量的指标。5-羟甲基糠醛[7]为黄精炮制后产生的化合物且含量变化巨大，其使用安全风险和治疗保健功效存在争议。因不同产地的黄精配方颗粒中5-羟甲基糠醛含量差异较大也将其列为主要成分[8]。2020年版《中国药典》对黄精含量测定项下的指标为多糖，而黄精炮制前后多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛含量都发生变化[9-11]。目前，黄精饮片常用色谱法开展质量评价，包括薄层色谱、高效液相色谱法、指纹图谱和液质联用法等手段[12-13]。基于绿色化学可持续发展理念，创新中药提取分析方法，构建绿色中药质量评价体系，建立一种快速无损，简便可靠的黄精饮片多指标定量方法尤为重要。

近红外光谱分析技术是通过照射红外光得到样品吸收光谱，反应样品中分子振动能级跃迁的信息，目前已广泛应用于食品、中药材真伪鉴别、产地鉴别及质量定量分析方面[14-15]，是一种有效的质量控制和鉴别技术，有检测快速、操作简便、高灵敏度等特点，且在多种药材有所应用，如延胡索、片姜黄、薏苡仁[16-18]等。在此基础上，本研究首次利用近红外光谱技术进行黄精饮片的质量控制，通过收集大量不同产地黄精饮片，以多糖、皂苷和5-羟甲基糠醛含量为黄精活性成分代表，采集所有样品的近红外光谱图，结合偏最小二乘法(PLS)建立黄精饮片多指标近红外定量模型，以期实现黄精饮片质量快速评价及控制。

1 材料

Antaris Ⅱ型傅立叶变换近红外光谱仪、TQ Analyst 8.3.125分析软件、U3000高效液相色谱仪(美国ThermoFisher公司)；UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；NT-xs105电子分析天平(0.01 mg，瑞士 Mettler Toledo公司)；DFD-700电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；MIL-SYN型超纯水仪(美国Milipore公司)。

无水葡萄糖标准品(纯度99%，批号G6172-500)、人参皂苷Rb1(纯度99%，批号110704-202129)均购自中国食品药品检定研究院；5-羟甲基糠醛标准品(纯度>98%，批号B21832)购自上海源叶生物有限公司；乙醇、二氯甲烷均为色谱纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。

138批黄精分别购自浙江中医药大学饮片有限公司、安徽亳州千草国药、山东博康药业、河北春开制药等16家国内中药饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定按2020年版《中国药典》中黄精含量测定项下的方法测定。以多糖质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)，得到回归方程A=20.682X+0.011 9(R2=0.998 9)，在0.003 1～0.023 2 mg/mL范围内线性关系良好，精密度、重复性、稳定性试验RSD分别为0.43%、1.07%、0.36%；平均加样回收率100.87%。

2.2 皂苷含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备精密称取黄精粉末0.5 g置于具塞锥形瓶中，加入80%乙醇25 mL，每个样品平行3份。60 ℃超声60 min，重复提取2次，过滤，合并滤液至50 mL量瓶中，用80%乙醇定容。

2.2.2 标准曲线精密称取人参皂苷Rb1对照品适量，甲醇溶解，得1.0 mg/mL对照品溶液。分别吸取对照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL于试管中挥干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，摇匀，在60 ℃水浴保温15 min后，冰浴2 min，加入5 mL冰醋酸溶液，摇匀，静置5 min[19]。以相应试剂为空白，于568 nm波长测定吸光度。以人参皂苷Rb1质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)，得到回归方程A=13.704X-0.015 9(R2=0.995 2)，在0.009 9～0.070 3 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 方法学考察精密吸取对照品溶液，按“2.2.2”项下方法连续测定6次，RSD为0.78%。取同一批样品，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下方法分别于0、5、10、20、40、60 min测定，RSD为1.35%，表明供试品溶液稳定性良好。取同一批样品，按“2.2.1”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.2”项下方法测定，RSD为0.61%，表明方法重复性良好。取已知皂苷含量的黄精样品粉末6份，每份0.5 g，精密加入人参皂苷Rb1对照品，测定平均加样回收率为99.83%，RSD为1.12%。

2.2.4 含量测定精密吸取供试品溶液0.1 mL，按“2.2.2”项下的方法测定，计算皂苷含量。

2.3 5-羟甲基糠醛含量测定

2.3.1 供试品溶液制备精密称取样品1 g于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL二氯甲烷，超声60 min，放冷，补重。精密吸取10 mL，蒸干，残渣加入甲醇溶解，转移置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，过0.22 μm滤膜即得。

2.3.2 对照品溶液制备精密称取19.37 mg 5-羟甲基糠醛于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，精密吸取上述溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容置刻度，摇匀，即得0.193 7 mg/mL对照品溶液。

2.3.3 色谱条件 Agilent ZORBAX-Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～16 min，7%A；16～17 min，7%～20%A；17～40 min，20% A)；检测波长300 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；体积流量1 mL/min[20]。色谱图见图1，各峰达到基线分离，分离度均大于1.5。

2.3.4 线性关系考察精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、30 μL测定，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得回归方程Y=45 317X+1.179 7(R2=0.999 3)，在0.000 1～0.005 8 μg范围线性关系良好。

2.3.5 精密度试验精密吸取对照品溶液，在“2.3.3”项下方法连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验取同一批样品，在“2.3.1”项方法制备供试品溶液，在“2.3.3”项下方法分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，RSD为0.72%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.3.7 重复性试验取同一批样品，在“2.3.1”项方法平行制备6份，按“2.3.3”项下方法进样分析，测定峰面积，RSD为1.68%，表明方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验取已知含量黄精粉末6份，每份1 g，精密加入5-羟甲基糠醛对照品在“2.3.1”项方法制备供试品溶液，测定平均加样回收率为99.12%，RSD%为0.74%。

2.4 近红外光谱采集将138批黄精粉碎后过5号筛，取约10 g于石英杯中摊平，以内置背景做参比扣除，采集光谱图。采样方式积分漫反射，波数区间3 999～10 001 cm-1，分辨率8.0 cm-1。室温23～27 ℃，重复扫描3次，取其平均光谱，见图2。

2.5 校正集与验证集的划分从138批黄精中随机选取16批作为验证集，122批作为校正集，含量测定结果见表1。

表1 校正集与验证集的含量测定结果

2.6 近红外光谱预处理定量模型的校正算法有逐步多远线性回归法(SMLR)、偏最小二乘法(PLS)、主成分回归法(PCR)。对于组分复杂的中药，多选用PLS[21-22]。以相关系数、均方差、预测均方差为考察指标进行考察，其中相关系数越接近1，均方差、预测均方差越接近0，模型预测精密度越好。首先通过多元信号校正(MSC)或标准正则变换(SNV)对由于样品颗粒和分布不规则引起的偏差进行消除，减少光散射或光程差造成的影响[23]；再通过原始光谱、一阶求导(1std)或二阶求导(2std)减轻光谱基线漂移；最后用无平滑(NS)、卷积平滑滤波(S-G)或者Norris导数平滑滤波(Nd)处理方法提高信噪比、减小随机误差[24]，见表2。由表2可知，当多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛分别选择MSC+1stD+NS、MSC+Spectrum+S-G、MSC+1stD+S-G方法处理时，相关参数最优，因此选用此方法对光谱数据预处理。

表2 不同光谱预处理方法对校正模型的影响

2.7 波段选择以性能指数为指标，通过TQ Analyst软件优化，选择最适宜分析的光谱波段，见表3，得到多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛最优波段分别为5 149.01～4 720.89、5 850.97～5 800.83、4 898.31～4 184.77、9 931.6～8 280.84 cm-1，模型预测精密度良好。

表3 不同光谱范围的影响

2.8 主因子数选择通过PLS建立定量模型时，主因子数的数量会影响定量模型的精密度。主因子数过少可能会导致精密度降低，主因子数过多可能会产生过拟合现象。通过预测残差平方和以及内部交叉验证均方根误差(RMSECV)筛选主因子数，考察主因子数对多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛的影响，结果表明最佳主因子数分别为6、9、5时模型的RMSECV最小，模型的准确度最高。

2.9 异常值剔除经光谱Outliers优化，以马氏距离作为评价指标，对异常值进行剔除，以保证模型的准确性，见图3。异常值检验表明样品均符合要求。

2.10 定量模型的建立与验证以筛选后的最优预处理方法作为参数评价指标(表4)，建立定量模型，具体模型参数及各个变量实际值与预测值的相关性见图4～6。

表4 定量模型参数评价指标

将预测集(n=16)样品光谱输入定量模型中，得出其预测值，通过预测值与实际值的相对偏差，考察模型的准确度，见表5与图7。多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛含量预测值与实际值的平均相对偏差分别为1.60%、0.87%、0.14%，均小于2%，t检验P值分别为0.92、0.84、0.86，均大于0.05，表明验证集预测值与检验值无显著性差异，模型准确度良好。

表5 验证集含量预测与结果偏差

2.11 定量模型方法学考察精密度试验，在“2.4”项下方法采集近红外光谱图6次，导入建立的近红外定量模型中，预测多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明该定量模型精密度良好。重复性试验，取同一批样品，分成6份，在“2.4”项下方法采集近红外光谱图，导入建立的近红外定量模型中，预测多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明该定量模型重复性良好。稳定性试验，取同一批样品，分别于0、1、2、4、8、12 d，在“2.4”项下方法采集近红外光谱图，导入建立的近红外定量模型中，预测多糖、皂苷、5-羟甲基糠醛含量，RSD均小于2%，表明该定量模型稳定性良好。