知母皂苷对葛根素在正常、糖尿病大鼠体内药动学的影响

黄海兰， 王 浩， 刘奕明,2， 林爱华

(1.广州中医药大学第二附属医院I期临床研究室，广东 广州 510120；2.广州中医药大学第二附属医院，广东省中医证候临床研究重点实验室，广东 广州 510120；3.广州中医药大学第二附属医院珠海医院，广东 珠海 519000)

葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，被用于治疗糖尿病及其并发症[1]，葛根素为其主要有效成分，可通过抑制胰岛细胞凋亡、上调胰岛素分泌[2]来降低血糖，同时具有保护心脑血管、抗炎等药理活性[3]，但它为P-糖蛋白(P-gp)底物[4]，水溶性、脂溶性均较低，大部分以原型从粪便排泄，绝对口服生物利用度仅约为7%[5]，限制了口服给药的临床应用，而注射液又易导致溶血和过敏反应[6]。因此，有必要探索更方便有效的方法来增加葛根素口服吸收。

葛根-知母为经典的治疗糖尿病药对，两药配伍兼具清热生津、滋阴润燥之功效[7]。知母皂苷为知母主要药理活性物质，可通过抑制TNF-α释放、上调细胞中IRS-1蛋白表达来改善高血糖[8]，对芒果苷在大鼠体内的吸收有明显促进作用[9]，但对葛根素是否有类似影响目前尚不明确。因此，本实验考察知母皂苷对葛根素在正常、糖尿病大鼠体内药动学的影响，评价该成分促吸收作用，以期为葛根-知母药对临床应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 TRIPLE QUADTM5500 型液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)，配置Turbo Ionspray离子源(ESI)、LC-30AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)、Analyst 1.7数据处理系统(美国AB公司)；5418R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；MS105DU电子天平[十万分一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)]；N-EVAP24进口氮吹仪(美国Organomation公司)。

1.2 试剂与药物 葛根素对照品(批号MUST-21010610，纯度>98%)，购自成都曼思特生物科技有限公司；芦丁对照品(批号O0714AS，纯度>98%)，购自大连美仑生物技术有限公司；知母皂苷冻干粉，实验室自制。肝素钠，购自上海如吉生物科技有限公司；链脲佐菌素(批号111607-200301，纯度≥98%)，购自美国Sigma公司。AB-8大孔吸附树脂，购自广州松洲国熙有限公司。知母(批号170408241，产地河北)，购自广东康美药业股份有限公司，经专家鉴定为正品。高糖高脂饲料(基础饲料52.2%，蔗糖20%，猪油15%，酪蛋白10%，胆固醇1.2%，磷酸氢钙0.6%，石粉0.4%，预混料0.4%)。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国默克公司；甲酸为分析纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；水为超纯水，经Milli-Q系统设备制备。

1.3 动物 SPF级SD大鼠，雄性，购自南方医科大学，体质量180～220 g，合格证号44002100028394，动物生产许可证号SCXK(粤)2016-0041。

2 方法

2.1 对照品、内标溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取葛根素对照品2.00 mg，甲醇溶解并定容，制成0.2 mg/mL贮备液，在-30 ℃下保存，用时甲醇依次稀释至0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/mL，分别精密吸取10 μL，90 μL空白血浆制成质量浓度为5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的溶液，即得。

2.1.2 内标溶液 精密称取芦丁对照品2.20 mg，甲醇溶解并定容，制成0.22 mg/mL贮备液，在-30 ℃下保存，用甲醇稀释至2.2 μg/mL，即得。

2.2 药液制备

2.2.1 知母皂苷 参考文献[9-10],取适量知母根茎粉碎，过60目筛，75%乙醇分别按料液比1∶8、1∶6各提取1次，每次1 h，趁热过滤，滤液浓缩至无醇味，离心后将上清液用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，洗脱体积流量为3 mL/min，分别以3倍柱体积纯水、6倍柱体积NaOH洗脱后，纯水洗脱至中性，20%、80%乙醇继续洗脱，收集80%乙醇洗脱液，浓缩至无醇味后冻干成粉末，醋酐-浓硫酸反应呈蓝绿色，表明所纯化有效部位为甾体皂苷，外标法[11]测得知母皂苷B2含量为87.7%，0.5%CMC-Na稀释至所需质量浓度，即得。

2.2.2 葛根素 精密称取葛根素对照品适量，0.5%CMC-Na稀释至10 mg/mL，即得。

2.3 糖尿病大鼠模型建立 12只正常大鼠适应性喂养普通饲料3 d后，再采用高糖高脂饲料喂养28 d。于第28天禁食不禁水12 h后，大鼠腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素，于给药后第3、7天检测空腹血糖(FBG),以FBG≥16.7 mmol/L为合格。

2.4 分组、给药与采血 24只正常大鼠随机分为4组，每组6只，给药前禁食不禁水12 h，分别灌胃给予葛根素(100 mg/kg)及葛根素-低、中、高剂量知母皂苷(50、100、200 mg/kg)混合药液；12只糖尿病大鼠随机分为2组，每组6只，分别灌胃给予葛根素及葛根素-知母皂苷(100 mg/kg)混合药液，于给药前和给药后0.083、0.167、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h眼眶采血各500 μL，置于含肝素钠的EP管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上层血浆，置于-80 ℃冰箱中保存待测。

2.5 LC-MS/MS条件

2.5.1 色谱 Inertsil ODS-3色谱柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～1 min，5%B；1～2 min，5%～30%B；2～4 min，30%～70%B；4～5 min，70%～5%B；5～7 min，5%B)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.5.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)；雾化温度450 ℃；喷雾电压(IS)-4 500 V；气帘气(CUR)20；碰撞气(CAD)7；氮气1(GS1)40；氮气2(GS2)50；负离子多反应检测模式(MRM)；定量离子对葛根素m/z415.1～295.1，芦丁m/z609.3～271.0。

2.6 血浆处理 血浆在室温下融化后取100 μL至EP管中，加入20 μL内标溶液，振荡10 s，再加入400 μL乙腈沉淀蛋白，振荡3 min，4 ℃、13 000 r/min离心15 min，取360 μL上清液，氮气吹干，吹干物用200 μL乙腈-水(30∶70)复溶，振荡3 min，微孔滤膜过滤，测定时进样5 μL作LC-MS/MS分析。

（3）桩孔必须挖一节、浇筑一节护壁，护壁高度一般为1m，严禁不及时浇筑护壁的冒险作业。对软弱地层、涌水涌沙地层，护壁节段高度可减少 0.3～0.5m。

2.7 数据处理与统计学分析 采用DAS 2.0软件中的非房室模型计算AUC、Cmax、Tmax、t1/2等主要药动学参数，其中Cmax，Tmax为实测值，AUC以梯形法测定。再通过SPSS 25.0软件进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性试验 取空白血浆、空白血浆+对照品(5 ng/mL)+内标、给药24 h后血浆适量，按“2.6”项下方法处理，在“2.5”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，葛根素测定不受内源性物质影响，表明该方法专属性良好。

3.1.2 线性关系考察 取含药血浆适量，按“2.6”项下方法处理，在“2.5”项条件下进样测定。以对照品、内标峰面积比值(Y)对血药浓度(X)进行回归，得方程为Y=0.011 5X+0.011 4(r=0.997 4)，在5～5 000 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为5 ng/mL。

3.1.3 精密度、准确度试验 分别配制含定量下限及低、中、高(10、200、4 000 ng/mL)质量浓度葛根素的质控血浆，按“2.6”项下方法处理，同一天内在“2.5”项条件下进样测定6次，考察日内精密度；同法每天测定1次，连续3 d，考察日间精密度，测得两者RSD分别不大于6.98%、7.47%。再以实测、真实质量浓度比值考察准确度，测得其数值在96.97%～103.21%范围内，均符合生物样品分析要求。

3.1.4 提取回收率、基质效应试验 配制含“3.1.3”项下3个质量浓度葛根素的质控血浆各6份，按“2.6”项下方法处理，在“2.5”项条件下进样测定，计算峰面积A1；取空白血浆适量，按“2.6”项下方法处理，其残留物用含5、100、2 000 ng/mL葛根素的乙腈-水(30∶70)复溶，在“2.5”项条件下进样测定，计算峰面积A2；将5、100、2 000 ng/mL对照品溶液溶于乙腈-水(30∶70)中，在“2.5”项条件下进样测定，计算峰面积A3，以A1/A2为提取回收率，A2/A3为基质效应，测得两者分别在88.94%～91.85%、96.32%～109.13%范围内，均符合生物样品分析要求。

3.1.5 稳定性试验 配制含“3.1.3”项下3个质量浓度葛根素的质控血浆，室温放置4 h，考察其室温稳定性；在-80 ℃下反复冻融3次，考察其冻融稳定性；在4 ℃进样器中放置24 h，考察其待测液稳定性；在-80 ℃冰箱中放置30 d，考察其长期稳定性，以当天标准曲线衡量的质量浓度并计算其准确度，测得其数值均在89.27%～110.00%范围内，表明葛根素在不同条件下稳定性良好。

3.2.1 正常大鼠 图2、表1显示，葛根素单一给药后Tmax较短，各时间点血药浓度较低；合用各剂量知母皂苷后葛根素Cmax、AUC0-∞升高(P<0.05)，CLZ/F下降(P<0.05)，提示知母皂苷可增加葛根素在正常大鼠体内的暴露水平，并降低后者消除速率。

表1 正常大鼠中葛根素主要药动学参数

3.2.2 糖尿病大鼠 图3、表2显示，与表1比较，葛根素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞降低(P<0.05)，与文献[12]报道一致；合用知母皂苷后，葛根素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，Tmax延长(P<0.05)，CLZ/F、VZ/F降低(P<0.01)，提示知母皂苷可增加葛根素体内暴露水平，并延迟后者吸收，降低后者消除速率。

表2 糖尿病大鼠中葛根素主要药动学参数

4 讨论与结论

在样品前处理过程中发现，乙酸乙酯萃取时提取回收率低，固相萃取时价格昂贵，而乙腈萃取时蛋白信号强。因此，选择乙腈作为提取溶剂。

研究表明，胡椒碱[13]、维拉帕米[14]可抑制CYP450酶、P-gp活性，减少葛根素代谢和外排，增加其体内血药浓度；知母皂苷BⅡ抑制药物代谢酶的作用较弱[15]，对P-gp活性的影响尚不明确。本实验发现，葛根素在糖尿病大鼠中的血药浓度降低，可能与糖尿病状态下Ⅱ相代谢酶UGT1a1、UGT1a7活性上升[12,16]，与葛根素代谢加快有关；知母皂苷对葛根素的吸收促进作用更强，可能与该成分在正常、病理状态下对葛根素吸收、代谢等过程的影响程度不同有关。

本实验中葛根素给药剂量参考文献[17]，并根据玉液汤[18]、芪参玉液胶囊[19]中知母与葛根1∶1的比例，探讨在该比例下知母皂苷对葛根素药动学的影响，并对两者以0.5∶1、2∶1比例配伍时进行相关考察，发现各剂量组无显著差异。前期报道，葛根素能延缓糖尿病并发症的发展[20]，提示知母皂苷增加该成分体内暴露量时，有利于它发挥上述作用，并且其剂量过高时的吸收存在自身浓度抑制现象[21]，故通过配伍等方式增加其吸收尤为重要。

综上所述，本实验研究知母皂苷对葛根素在大鼠体内药动学的影响，可为葛根-知母药对临床应用提供依据。另外，知母皂苷B2能促进芒果苷吸收[22]，而本实验所用的知母皂苷也主要为该类型，同样可促进葛根素吸收，提示它有望成为促吸收中药的成分，其机制有待进一步研究。