小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖技术

黄松殿 俞建妹 何乐祖 刘芳 沈遐 韦丽

小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖技术

黄松殿 俞建妹 何乐祖 刘芳 沈遐 韦丽

（广西壮族自治区南宁树木园 广西南宁 530031）

为探索野生小叶红叶藤的驯化快繁技术，以野生小叶红叶藤优良单株种子为试验材料，开展种胚外植体消毒、始芽诱导、扩繁、生根及移栽研究。结果表明：75%酒精处理30 s+1‰ HgCl2溶液消毒10 min，外植体无菌率100%；增殖培养基以MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.30 mg/L，增殖率可达18倍；生根培养基1/3 MS+NAA 1.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L，生根率达97.59%；移栽基质泥炭土与黄心土体积比为1∶5，组培生根瓶苗移栽成活率为95%。本研究为小叶红叶藤组织培养和彩化种苗供应提供参考依据。

小叶红叶藤；组织培养；快繁技术

小叶红叶藤[(Hook.et Arn) Planch)]，牛栓藤科红叶藤属植物，攀援灌木，多分枝，高1～4 m，产于福建、广东、广西、云南等省区，生长于海拔100～600 m的山坡或疏林中[1]。小叶红叶藤具有观赏价值，其鲜红色的嫩叶和果实具有非常好的景观效果[2]，可用于营建彩篱、孤植木、园景点缀等景观[3]；此外，小叶红叶藤也是一种民间药，其茎叶可用于清热解毒、消肿解痛、止血，主治跌打肿痛，外伤出血等[4]；另外，该植物具有特殊的芳香气味，在广西壮族地区常用作清热解毒、美容养颜、延年益寿的天然保健茶饮品[5]。小叶红叶藤主要以野生为主，少有人工种植，为了更好地利用和开发此品种，快速大量地进行人工栽培，采用组织培养的方式进行驯化、繁殖，并推广种植，利于园林景观中彩化品种选择及药材的采集。植物组织培养育苗繁殖周期短、效率高，不受季节和气候限制，可保持亲本的优良性状，且生长整齐标准[6-8]。针对小叶红叶藤组织培养，吕华丽等[9]对小叶红叶藤进行组培诱导研究,目前未见小叶红叶藤芽苗组织培养及再生植株移栽的相关研究报道。本研究以野生小叶红叶藤种子为外植体，通过种胚消毒灭菌及无菌苗培养、芽增殖、壮苗、生根和再生植株移栽，建立小叶红叶藤的种胚组培快繁育苗体系，为其苗木的规模化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试种子来源于广西南宁市南宁树木园连山管理区阔叶林中的野生小叶红叶藤。

1.2 方法

1.2.1 种子及种胚消毒灭菌方法 采摘6～8成熟的野生小叶红叶藤种子，将其分成两部分（种子+种胚）分别进行外植体消毒灭菌；把带种皮与去掉种皮及假种皮后的种胚分别放入不同消毒剂中消毒（表1），随后接种。每处理接种20瓶，每瓶接1粒种子或种胚，培养15 d后观察统计污染情况。

表1 种子及种胚不同消毒灭菌的方法

1.2.2 激素对芽增殖的影响 将小叶红叶藤种子和种胚消毒后分别接种于添加6-BA 0.1 mg/L、NAA 0.02 mg/L及无外源激素的MS始芽培养基中，观察芽苗不定芽分化及生长情况。胚芽抽长生长快，在各种培养基中接种后5 d内可抽长至3 cm，在添加外源激素的情况下，其子叶均带腋芽，但腋芽抽长生长较慢；在不添加外源激素的情况下，胚芽在长至10 cm后会停止抽长且难以分化出不定芽。为了能诱导出不定芽，将抽芽剪至2～3 cm的单芽，分别接种于添加6-BA(0.1～ 1.0 mg/L)、NAA(0.02～0.60 mg/L)的MS增殖培养基中，每处理接种30瓶，每瓶接单芽5个，3个重复，培养30 d后观察统计芽增殖情况。

1.2.3 不同添加物对壮苗的影响 芽苗在培养过程中会出现黄化、落叶、芽苗枯死现象。为了解决这一问题，在培养基中添加酸水解酪蛋白（Casein hydrolysate）（简称CH）（20～100 mg/L）、防落素（学名4-氯苯氧乙酸，英文名4-Chlorophen­oxyaceticacid，齐云生物技术）（5～15 mg/L）、VC（10～20 mg/L）及核黄素（10～20 mg/L），分别进行不同浓度的试验。每处理接种30瓶，每瓶接丛芽4个，3个重复，培养30 d后观察芽苗生长情况。

1.2.4 不同生根培养基对芽苗生根的影响 挑选顶芽叶片舒展、叶色翠绿、生长健壮、高3～4 cm的1～3个单芽或丛芽接种于生根培养基中。优化生根培养基以1/3 MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）及IBA（1.0、1.5、2.0 mg/L），采用正交设计9（34）进行试验。每种处理20瓶，每瓶9株（丛），3次重复，培养40 d后统计生根情况。

1.2.5 不同移栽方式对组培生根瓶苗移栽成活率的影响移栽场地为绿篱东边区域，选用泥炭土与黄心土，按1∶5（∶）的比例搅拌均匀，分别起奎或装进16 cm×16 cm的育苗杯中进行备用。组培生根瓶苗移栽2个月后统计成活率。

1.2.6 数据分析方法 试验采用Excel 2017及SPSS 22.0进行数据统计及分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式下种子及种胚脱毒情况

果皮易沾染真菌、细菌，且存在部分菌类侵入种皮，因此难以通过常规的消毒剂进行完全消毒。酒精消毒具有一定的穿透性，材料经75%酒精处理后再用消毒剂处理，效果较好。小叶红叶藤种皮表面附着物较多，种子经消毒剂处理后无菌率最高为25%（处理4），见图1。由于种子成熟度处于6～8成，种皮处于完全闭合状态，种胚外还存在一层包裹严密的假种皮，种胚受菌类感染的可能性较小，在进行消毒处理时较容易清除附着在种皮及假种皮上的部分菌类，种胚无菌率较高可达100%（处理7，75%酒精处理30 s+1‰ HgCl2溶液消毒8 min；处理9，75%酒精处理30 s+1‰ HgCl2溶液消毒10 min）。未经消毒剂处理的种胚，接种于始芽诱导培养基后第7天开始抽芽，而经消毒剂处理的种胚在第13天开始抽芽（图2-A），种子催芽失败。由此可知，消毒剂对胚芽具有一定的损伤作用，导致其萌动时间有所延长；由于种子处于未完全成熟阶段，且培养瓶中氧气有限，一定程度限制了种子发芽。

图1 不同消毒方式下种子及种胚脱毒情况

2.2 激素对芽增殖的影响

从表2可知，当6-BA含量低于0.8 mg/L时，单芽芽苗增殖系数小于或等于10，其不定芽疏散，叶片大；当6-BA含量达到0.8 mg/L以上时，芽苗增殖系数达到18以上，但随着6-BA含量的增加，芽苗纤细，节间长，长势快，同时随着NAA含量的增加，会出现玻璃化现象。在培养的过程中，由于激素含量相对高，芽苗分化及芽抽长长势快，生长15～20 d后易出现黄化、落叶、芽苗枯死现象。培养基难以在30～35 d内持续提供足够的营养来满足不定芽的伸长生长及木质化需求，难以达到一周期一扩繁的目的，转接周期短，成本相对高。因此，从壮苗扩繁及降低成本方面考虑，处理7号为芽苗增殖的最佳培养基，芽苗增殖情况见图2-B。

A.胚芽抽长；B.增殖；C.黄化枯死；D.壮苗；E.生根苗；F.移栽成活苗（2个月后）。

表2 激素对芽增殖的影响

注：不同小写字母表示差异达到显著水平(<0.05)，下同。

2.3 不同添加物对壮苗培养的影响

为了使芽苗在一个周期内达到足够木质化，避免一定的黄化、落叶及不定芽局部枯死现象（图2-C），进行分段、分丛芽扩繁，在最佳继代培养基中添加改良的药剂，见表3。观察处理6可知，芽苗在添加有不同药剂的培养基中连续培养2～3周，不定芽局部枯死或黄化现象可完全被控制，未出现芽苗整株枯死现象，大量落叶现象改善为偶有落叶，其丛芽健壮，枝繁叶茂，达到壮芽的要求，可用于生根（图2-D）。可能原因是，CH是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，加快了芽苗体内的新陈代谢；VC是植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质,具有延缓植物细胞衰老的作用；核黄素是酶辅因子黄素单核苷酸FMN和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的直接前体，广泛参与植物代谢中的氢、氧与电子传递反应，发挥着不可或缺的作用。

表3 不同添加物对壮苗的影响

2.4 不同生根培养基对丛芽苗生根的影响

从表4中可知，丛芽生根率在外源生长素正交设计9（34）各处理中呈显著性差异。生根率大小依次为：处理6>处理5>处理7>处理8>处理9>处理4>处理3>处理2>处理1；处理4、处理7在第8天开始生根，处理8在第9天开始生根，处理5、处理6在第10天开始生根。从丛芽生根持续时间来看，丛芽在处理5、处理6中生根持续时间约为10 d，生根率均在90%以上，出根整齐，单丛生根量为3～8条，适合移栽和批量生产，便于管理。在其他处理中，芽苗持续生根时间在15～25 d，部分单丛生根量低于2条，不适合移栽。综合以上情况可知，最佳的生根培养基为处理6（丛芽生根情况见图2-E）。

表4 不同生根培养基对丛芽生根的影响

2.5 不同移栽方式对组培生根瓶苗移栽成活率的影响

在起奎及育苗杯中分别移栽200丛生根丛芽，在摆放区域条件、管理条件一致的情况下培育2个月后统计成活率。直接移栽在奎中的苗木成活率为75%，育苗杯中的苗木成活率为95%（图2-F）。可能原因是，丛芽根系粗壮，基质中缝隙较大，生长空间良好，且保水效果好；在奎中的基质因为无固定边界，在淋水时易发生位移，与丛芽根系形成空隙，不保水，导致根系易因缺水而死亡；育苗杯中的基质因有固定围合边界，在淋水时水易下沉，且易与根系紧密结合，便于根系吸收水分与生长，促进苗木成活。因此，组培生根瓶苗宜使用育苗杯移栽。

3 讨论与结论

植物组织培养中常使用外源激素促进芽苗增殖，但在组培过程中常伴有黄化、枯死、玻璃化等现象，易导致试验材料的浪费及延缓试验进度。已有文献[10-11]指出，玻璃化现象可通过培养基成分和培养环境的改变来预防、控制与复壮。关于植物组织培养中黄化、枯死等不良现象的文献报道较少，而关于玻璃化现象的文献较多，其中针对芽苗不良现象，复壮方法采取较多的是改变pH[12-13]、激素配比[14]等，均能取得较好的效果。

本试验中野生小叶红叶藤种子成熟度处于6～8成，种胚处于完全密闭的空间内，不受外界菌类侵染，无菌率可高至100%；其胚芽已发育完全，在接种后第7—13天开始抽芽，生长良好。将剪下的芽苗接种在含外源激素6-BA 0.8 mg/L、NAA 0.3 mg/L的增殖培养基中，可分化出的不定芽多且健壮。芽苗因增殖率高，对培养基营养元素的消耗也多，易出现玻璃化现象，或因营养供应不上而出现黄化、落叶等现象。为了维持不定芽的健壮生长，在培养基中添加CH 100 mg/L、防落素15 mg/L、VC 20 mg/L及核黄素20 mg/L，可有效地改善芽苗生长情况，使丛芽健壮、枝繁叶茂。

本试验中小叶红叶藤丛芽在添加NAA 1.0 mg/L、IAA 1.5 mg/L及IBA 1.0 mg/L的改良MS生根培养基中，生根率可达97.59%，根系健壮，适合在育苗杯中移栽，移栽成活率可达95%。小叶红叶藤芽苗在生根试验中表现出丛生芽易生根，而单芽则出现生根难的现象。芽苗诱导出的不定根主要表现为愈伤根和皮部根，皮部根的维管束一般是与茎的维管束连通的，而愈伤组织形成的愈伤根与茎的输导组织不连通。输导组织不通是试管苗根系质量的主要问题，也是限制移植成活的主要因子[15]。本试验中的苗木移栽成活率为75%～95%，其不定根的种类需经进一步的解剖分析。

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Seed and Embryo Tissue Culture and Propagation Technology of(Hook.et Arn)Planch

HUANG Songdian YU Jianmei HE Lezu LIU Fang SHEN Xia WEI Li

(Nanning Arboretum of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning, Guangxi 530031, China)

Exploring the domestication and rapid propagation technology of wild(Hook.et Arn)Planch, the fine single seed of wild(Hook.et Arn) Planch was used as experimental material to study explant disinfection, bud induction, propagation, rooting and transplanting . The results showed that the explants were treated with 75% alcohol for 30 s+1 ‰ HgCl2solution for 10 min, and the sterility rate was 100%. The proliferation rate could reach 18 times when MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.30 mg/L was used as the proliferation medium.The rooting rate was 97.59% when the rooting medium was1/3 MS+NAA 1.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L.The survival rate of rooting bottle seedlings was 95% when the ratio of peat soil and yellow soil was 1:5. This study, provide theoretical and reference basis for tissue culture and colorful seedling supply.

(Hook.et Arn)Planch; tissue culture; rapid propagation technology

S687

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.06.009

2022-02-25；

2022-03-30

黄松殿（1966—），男，本科，高级工程师，研究方向为森林培育、植物栽培、植物分类，E-mail：461454946@qq.com。

（责任编辑 林海妹）