桂枝茯苓丸含药血清对多囊卵巢综合征小鼠卵巢颗粒细胞自噬的影响

陈海燕， 朱鸿秋， 朱 影， 胡小丹， 吴沛娟， 吴晗雪

(1.成都中医药大学，四川 成都 610072；2.成都中医药大学医学与生命科学院，四川 成都 610072)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种以雄激素过高、排卵障碍和卵巢多囊样改变为临床特征的内分泌紊乱综合征，也是导致育龄期女性月经失调和不孕的重要原因[1]，绝经期患者发生高血压、糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌的风险较健康女性明显增高[2]，是危害女性健康的难治病。目前，治疗PCOS大多采用生活方式干预、激素或手术的综合方案，但存在治疗周期长、并发症多、疗效欠佳等问题。

桂枝茯苓丸作为妇科经典名方，既往研究发现其辅助治疗PCOS，在调整内分泌、改善代谢水平、促排卵等方面效果甚佳[3-4]。课题组前期研究发现，桂枝茯苓丸可调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞过度自噬，从而缓解PCOS大鼠的排卵障碍[5]，但其对自噬更深层次的调控机制尚不明确。研究表明，lncRNAH19和miR-29b-3p不仅参与卵巢功能的调控及有关疾病的发生[6-7]，而且与全身多处细胞自噬调节有关。因此，本研究通过探讨桂枝茯苓丸含药血清是否可以调节H19/miR-29b-3p表达，参与卵巢颗粒细胞自噬的调控，以期为桂枝茯苓丸治疗PCOS提供一定的依据，并为后续的治疗提供基因靶点。

1 材料

1.1 动物 40只SPF级雌性BALB/c小鼠，体质量18～20 g，未孕，6周龄，购于南京大学动物模式中心，实验动物生产许可证号SCXK(苏)2015-0001，饲养于成都中医药大学实验动物研究中心，设定室内温度为(22±2)℃，自由饮水进食，实验动物使用许可证号SYXK(川)2019-049。动物实验内容经成都中医药大学实验动物伦理委员会审核通过。

1.2 细胞株 正常小鼠卵巢颗粒细胞；PCOS小鼠卵巢颗粒细胞，为实验室自行提取。

1.3 试剂与药物 桂枝茯苓丸(成都九芝堂金鼎药业有限公司，批号Z2002370)，取140.4 mg，研钵研磨后加入20 mL无菌生理盐水制成混悬液。胎牛血清(FBS)(美国HyClone公司，批号SH30071.03HI)；DMEM F12培养基(美国Gibco公司，批号31330095)；青霉素、链霉素、巴佛洛霉素A1、嘌呤霉素(美国Sigma公司，批号I9532、85886、196000、540222)；睾酮(T)ELISA试剂盒(美国R&D公司，批号KGE010)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司，批号KGA224)；十二烷基硫酸钠[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号A100227]；蛋白裂解液(RIPA)(上海碧云天生物技术有限公司，批号P0013B)；q-PCR试剂盒、Trizol试剂、质粒抽提试剂盒(日本TaKaRa公司，批号RR014A、9108Q、6023D)；SYBR Green miRNA荧光定量PCR试剂盒、组织/细胞miRNA提取试剂盒(哈尔滨新海基因检测有限公司)；iScript cDNA合成试剂盒(美国Bio-Rad公司，批号1708890)；pLVX-EGFP-C1载体(美国Creative Biogene公司，批号OVT2755)；Lipofectamine® RNAiMAX、Lipofectamine 3000(美国Thermo Fisher公司，批号13778030、L3000001)；萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒、QuickMutationTMPlus基因定点突变试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号RG052S、D0208S)；pMIR-REPORT 质粒(美国Ambion公司，批号AM5795)；微管相关蛋白1轻链3(LC3)B抗体(美国CST公司，批号2775)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔、兔抗小鼠免疫球蛋白 G(IgG)(英国Abcam公司，批号ab8245、ab6721、ab6728)。miR-29b-3pinhibitor(序列UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU)、inhibitor-NC(序列 CAGUACUUUUGUGUAGUACAA)(南京达恩医药科技有限公司)。

1.4 仪器 Criterion型电泳槽、Trans-Blot型转印槽(美国Bio-Rad公司)；Tanon 6600型发光成像工作站(上海天能科技有限公司)；3K15型低温高速离心机(美国Sigma公司)；EG1150H型石蜡包埋机、RM2245型切片机(德国Leica公司)；CKX31型倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)；LB941型微孔板式多功能酶标仪(德国Berthold公司)；ZS-MV-IV型小动物麻醉机(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；DxFlex型流式细胞仪(美国Beckman公司)；7500型实时荧光定量PCR 仪(美国ABI公司)；Nanodrop 2000型超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 模型建立 将20只小鼠按随机数字表法分为对照组和模型组，每组10只，使用来曲唑CMC溶液+高脂乳剂进行造模[8]，连续灌胃21 d，禁食12 h后处死，采用HE染色镜检+血清睾酮检测+体质量监测来确认造模成功与否[9]；对照组仅使用CMC溶液灌胃21 d。所有小鼠造模期间均正常饮水，喂养颗粒饲料。

2.2 含药血清制备 将20只小鼠随机分为2组，每组10只，分别灌胃给予70.2 mg/kg桂枝茯苓丸混悬液和等体积生理盐水，每天2次，连续3 d，最后1次灌胃后1 h麻醉小鼠，腹主动脉采血，常温静置4 h，3 000 r/min离心15 min，取血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，56 ℃水浴灭活30 min，将灭活后的小鼠空白血清和桂枝茯苓丸含药血清置于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3 卵巢颗粒细胞分离及培养 将“2.1”项下正常小鼠和PCOS小鼠处死后，于无菌条件下摘除卵巢，PBS冲洗3次，去除周围脂肪和被膜，用1 mL注射器针头刺破卵巢卵泡，收集颗粒细胞，0.075 mm筛网过滤，离心后弃上清，加入完全培养基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10% FBS 的 DMEM/F12培养基)重悬，观察细胞贴壁情况，待长至90%融合度时消化、收集，用完全培养基重悬，正常小鼠卵巢颗粒细胞和PCOS小鼠卵巢颗粒细胞分瓶培养，隔天换液，用于后续实验。

2.4 卵巢颗粒细胞分组及给药 ①为验证PCOS小鼠卵巢颗粒细胞的自噬水平，明确H19和miR-29b-3p在PCOS小鼠卵巢颗粒细胞中的表达及桂枝茯苓丸含药血清干预后两者的变化，将细胞分为对照组、模型组、桂枝茯苓丸含药血清组，对照组和模型组使用10%空白血清培养72 h；桂枝茯苓丸组使用10%含药血清培养72 h。②为明确桂枝茯苓丸含药血清对PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬的影响，以及调控H19/miR-29b-3p表达对颗粒细胞自噬的影响，将细胞分为模型组、桂枝茯苓丸含药血清组、桂枝茯苓丸含药血清+oe-Vector组、桂枝茯苓丸含药血清+oe-H19组、桂枝茯苓丸含药血清+inhibitor-NC组、桂枝茯苓丸含药血清+miR-29b-3p-inhibitor组，模型组使用10%空白血清培养72 h；桂枝茯苓丸含药血清组使用10%含药血清培养72 h；桂枝茯苓丸含药血清+oe-Vector组卵巢颗粒细胞转染空载质粒后使用10%含药血清培养72 h；桂枝茯苓丸+oe-H19组卵巢颗粒细胞转染H19高表达质粒后使用10%含药血清的培养72 h；桂枝茯苓丸含药血清+inhibitor-NC组卵巢颗粒细胞转染inhibitor-NC后使用10%含药血清培养72 h；桂枝茯苓丸含药血清+miR-29b-3p-inhibitor组卵巢颗粒细胞转染miR-29b-3p-inhibitor后使用10%含药血清培养72 h。

2.5H19基因过表达慢病毒载体构建 针对H19的基因序列，设计特异引物，PCR扩增H19的基因片段，将其插入到慢病毒载体pLVX-EGFP-C1之中，构建重组慢病毒质粒，鉴定测序后将重组慢病毒质粒、pHelper1.0载体质粒和 pHelper 2.0载体质粒共转染到293 T细胞中，包装产生慢病毒，并测定滴度。转染前24 h，将PCOS小鼠卵巢颗粒细胞，以每孔0.5×105个的密度接种至24孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜，将孔内培养基换成0.5 mL Polybrene-培养基混合物，根据感染复数(MOI)值，向每孔内加入20 μL慢病毒，孵育过夜，弃去液体，每孔加入1 mL完全培养基，于培养箱中继续培养，待细胞长满后，按照1∶3比例进行传代，培养48 h后，将培养皿中的细胞培养基换成含200 μg/mL嘌呤霉素筛选培养基，筛选稳定转导的细胞株。

2.6 miRNA转染 转染前1 d，接种适量细胞至6孔板中，当细胞融合度达60%～80%后，开始转染。使用灭菌ddH2O配制浓度为20 μmol/L的母液；取10 μL miRNA inhibitor加入250 μL OPTI-MEM培养基中，室温孵育5 min，记为A液；取15 μL RNAiMAX Reagent加入250 μL OPTI-MEM培养基中，室温孵育5 min，记为B液；将A液与B液轻轻混匀后，超净台上静置20 min。混合物静置期间，吸弃6孔板中培养基，每孔加入2 mL OPTI-MEM培养基，于培养箱中继续培养20 min，吸弃培养基，分别将miR-29b-3pinhibitor(100 nmol/L)、miR-29b-3pinhibitor NC(100 nmol/L)与转染试剂混合物加入6孔板中，再加入1.5 mL细胞培养基，混合均匀，在37 ℃下培养48 h。

2.7 荧光素酶报告基因检测 构建荧光素酶报告基因质粒pMIR-REPORT-LncRNAH19，利用QuickChange Mutagenesis Kits试剂盒将pMIR-REPORT-LncRNAH19中LncRNAH19与miR-29b-3p的结合位点进行突变。将293 T细胞按50%的密度接种到96孔板内，按照实验需要分为LncRNAH19-WT+mimics-NC、LncRNAH19-MT+mimics-NC、LncRNAH19-WT+miR-29b-3pmimics、LncRNAH19-MT+miR-29b-3pmimics。配置含有质粒、mimics-NC/miR-29b-3pmimics、Lipofectamine 3000 转染试剂的混合溶液，室温静置20 min，将其加入96孔板中，转染48 h，使用酶标仪检测荧光素酶活性。

2.8 检测指标

2.8.1 小鼠体质量、睾酮水平及卵巢病理形态学检测 自造模起，每3 d于灌胃前固定时间称量小鼠体质量，记录体质量变化。小鼠造模结束后禁食12 h，麻醉后腹腔主动脉采血，室温静置2 h，4 ℃、1 500×g离心10 min，取血清，ELISA法检测睾酮水平。取小鼠卵巢组织，将其制作成石蜡切片，常规脱蜡水化，苏木素核染，盐酸乙醇分化，伊红染液染色，脱水、透明后中性树胶封片，于相差显微镜400倍视野下观察并拍照。

2.8.2 流式细胞仪检测卵巢颗粒细胞自噬率 细胞按“2.4”项下方法处理，胰酶消化后重悬细胞，调整细胞密度至1×106/mL，取适量细胞悬液至EP管中，MDC染色，浓度为0.05 mmol/L，37 ℃孵育60 min，PBS清洗后，采用流式细胞仪定量分析其着色荧光强度(488 nm激发波长，检测30 000个细胞)。

2.8.3 RT-qPCR法检测LncRNAH19、miR-29b-3pmRNA表达 细胞按“2.4”项下方法处理，收集细胞，LncRNAH19的检测采用TRIzol法提取细胞总RNA，Nanodrop 2000检测mRNA浓度，按照逆转录反应试剂盒说明书合成cDNA，利用相应引物进行PCR扩增，结果采用 2-ΔΔCT法进行计算。miR-29b-3p的检测使用miRNA提取试剂盒抽提miRNA，反转录反应液配置体系为microRNA 4 μL、4×One step miRNA RT Solution 5 μL、10×miRNA RT Primer 2 μL、RNase Free H2O补至20 μL，利用相应引物进行PCR扩增。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.8.4 Western blot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达 细胞按“2.4”项下方法处理后收集，加入RIPA细胞裂解液，BCA法进行蛋白定量，加入5×loading buffer沸水浴10 min，即得蛋白样品，在-20 ℃下保存备用，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜，加入LC3 Ⅱ/Ⅰ一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，使用化学发光试剂显影，采用Tanon 6600发光成像工作站曝光，Image Pro Plus 6.0软件对条带光密度值进行分析，将目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值作为蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 PCOS模型建立 与对照组比较，模型组小鼠体质量、血清睾酮水平均升高(P<0.01)，见图1A～1B。如图1C所示，对照组小鼠颗粒细胞排列整齐致密，层次较多，卵泡膜细胞层无明显增厚；模型组小鼠颗粒细胞排列疏松，部分有脱落，层次减少，卵泡膜细胞层增厚，卵巢闭锁卵泡增加，卵泡的直径增大，提示造模成功。

3.2 PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬水平 如图2A所示，与对照组比较，模型组卵巢颗粒细胞自噬率增加(P<0.01)。如图2B所示，与对照组比较，模型组卵巢颗粒细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高(P<0.01)。与瞬时LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表达比较，一段时间内两者积聚程度更能体现自噬的改变，因此，2组同时添加10 nmol/L巴佛洛霉素A1对自噬溶酶体降解途径进行阻断，结果同样显示LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高(P<0.01)。

3.3 桂枝茯苓丸含药血清对卵巢颗粒细胞H19、miR-29b-3pmRNA表达的影响 如图3所示，与对照组比较，模型组卵巢颗粒细胞中H19 mRNA表达升高(P<0.01)，miR-29b-3pmRNA表达降低(P<0.01)；与模型组比较，桂枝茯苓丸含药血清组卵巢颗粒细胞中H19、miR-29b-3pmRNA表达发生逆转(P<0.01)。

3.4H19与miR-29b-3p的靶向关系 如图4所示，与mimics-NC+LncRNAH19-WT比较，miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-WT荧光素酶活性降低(P<0.01)；与miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-WT比较，miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-MT荧光素酶活性升高(P<0.01)，说明H19和miR-29b-3p有结合位点。

3.5 桂枝茯苓丸含药血清及调控H19/miR-29b-3p表达对PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬率的影响 如图5所示，与模型组比较，桂枝茯苓丸含药血清组卵巢颗粒细胞自噬率降低(P<0.01)，提示桂枝茯苓丸含药血清可降低PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬水平；过表达H19或抑制miR-29b-3p表达后，卵巢颗粒细胞自噬率仍升高(P<0.01)，提示过表达H19或抑制miR-29b-3p的表达均可减弱桂枝茯苓丸对PCOS小鼠颗粒细胞过度自噬的抑制作用。

3.6 桂枝茯苓丸含药血清及调控H19/miR-29b-3p表达对PCOS小鼠卵巢颗粒细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响 如图6所示，与模型组比较，桂枝茯苓丸含药血清组卵巢颗粒细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P<0.01)，提示桂枝茯苓丸含药血清可降低PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬水平；过表达H19或抑制miR-29b-3p表达后，卵巢颗粒细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达仍升高(P<0.01)，提示过表达H19或抑制miR-29b-3p的表达可减弱桂枝茯苓丸对PCOS小鼠颗粒细胞过度自噬的抑制作用。本组实验同样添加了10 nmol/L巴佛洛霉素A1对自噬溶酶体降解途径进行阻断，以消除其影响，各组结果趋势与未添加巴佛洛霉素A1一致。

4 讨论

流行病学调查显示，近年来PCOS发病率呈逐年上升的趋势，我国育龄期女性患病率为5.6%[10]，PCOS患者约占不孕人群的1/3[11]。尽管对PCOS的研究开展多年，其病因和发病机制仍然不明确，也缺乏针对性的治疗药物和手段。越来越多证据表明，非编码RNA和自噬与PCOS发病过程密切相关[12-13]，非编码RNA可通过调节细胞自噬，影响多种疾病发生发展[14]，但目前在关于PCOS的研究中，并未见报道。中医学认为PCOS属于“不孕”“癥瘕”“闭经”范畴，“痰湿瘀血”是其主要病机[15]。桂枝茯苓丸的君药桂枝温通行瘀滞；臣药桃仁助君祛瘀；佐药丹皮、芍药活血散瘀，茯苓渗湿利浊，全方共奏化痰利水、活血化瘀之功，契合PCOS痰湿瘀血之病机。

非编码RNA是指不翻译蛋白的RNA，其中包括LncRNA和miRNA，可在多个水平调控基因表达和蛋白质功能。近年来研究发现，非编码RNA在PCOS中应用潜力巨大，多种非编码RNA在PCOS患者或动物模型的血清、卵泡液、颗粒细胞中均有不同程度的差异表达，可作为特异性的诊断和治疗靶点[12]。H19是第一个被发现的LncRNA，研究人员发现在PCOS患者的血液、卵巢颗粒细胞中，H19表达升高，认为其可作为生物学标志物为PCOS的诊断提供参考[16-17]。LncRNA最常见的调节机制是作为竞争性内源性RNA与miRNA 相结合调控下游靶基因的表达[18]。王滟等[19]在卵巢癌细胞中发现，H19表达上调，miR-29b-3p表达下调，H19可靶向下调miR-29b-3p促进人卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移。本研究证实，在PCOS小鼠卵巢颗粒细胞中H19表达升高，miR-29b-3p表达降低，使用桂枝茯苓丸含药血清干预后，颗粒细胞中H19、miR-29b-3p表达发生了逆转，荧光素酶报告基因检测显示H19与miR-29b-3p有结合位点，故推测桂枝茯苓丸可能通过调节H19/miR-29b-3p表达起到治疗PCOS的作用。

多项研究表明，PCOS卵巢颗粒细胞自噬异常激活，过度自噬会引起细胞结构的破环，影响卵细胞正常发育，导致排卵障碍和性激素合成失调[20-21]，通过改变颗粒细胞自噬水平有望成为治疗PCOS的新方法。自噬受多种信号分子调节，研究表明非编码RNA可通过参与自噬调控网络，介导自噬相关基因的转录和转录后调控[22]。H19和miR-29b-3p曾被证实在多种肿瘤疾病中参与对自噬的调控，H19在肝癌细胞中高表达，敲除H19后，可下调自噬小泡及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，增加细胞活性[23]；在胃癌细胞中miR-29b-3p表达降低，过表达miR-29b-3p可下调其靶基因，从而调节自噬[24]，因此，H19/miR-29b-3p很可能是调节自噬的关键基因靶点。本研究发现，PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬水平升高，与既往研究相一致，桂枝茯苓丸含药血清可降低其自噬水平，而过表达H19或抑制miR-29b-3p表达，则减弱了桂枝茯苓丸对PCOS小鼠颗粒细胞过度自噬的抑制作用，说明H19/miR-29b-3p参与调控PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬。

综上所述，桂枝茯苓丸含药血清可通过调控H19/miR-29b-3p途径，抑制PCOS小鼠卵巢颗粒细胞自噬水平，对卵巢颗粒细胞起保护作用，为桂枝茯苓丸防治PCOS提供了新的思路和方法。