恩格列净对大鼠造影剂相关急性肾损伤的作用及其机制*

胡陶，王明亮，王武帅，何滢蓉，杨曦，孙雄山，王强△

（1西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2西部战区总医院心血管内科，四川 成都 610083；3西南交通大学医学院，四川 成都 610031）

根据《中国心血管健康与疾病报告2021》，冠心病的发病率和死亡率逐年增高，随着经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）的广泛开展，冠心病的治疗取得了长足的进步，然而PCI术后较为常见的并发症造影剂相关急性肾损伤（contrast-associated acute kidney injury，CA-AKI）的发病率一直居高不下，尤其在糖尿病合并冠心病的患者中高发，严重影响了患者的预后［1］。恩格列净（empagliflozin，EMPA）属于钠-葡萄糖共转运蛋白-2抑 制 剂（sodium-glucose cotransporter-2 inhibitor，SGLT-2i），通过抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，使过量的葡萄糖从尿液中排出，从而发挥降糖作用。最新一系列研究证实，恩格列净除降低血糖外，还具有心血管保护效应，可显著降低心力衰竭患者住院率和心血管患者死亡率等，改善了患者的预后和生存质量［2-4］。目前恩格列净被广泛应用于糖尿病和心血管疾病的治疗，然而恩格列净对造影剂相关急性肾损伤的作用尚不清楚。

本研究拟通过构建大鼠CA-AKI模型，观察恩格列净对大鼠造影剂相关急性肾损伤的防治作用，并初步探讨其可能的机制，旨在为糖尿病合并冠心病患者的CA-AKI防治提供实验参考。

材料和方法

1 动物

SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，6～8周龄，230～250 g，共40只，购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004，所有程序均符合机构规定，并经中国人民解放军西部战区总医院伦理委员会批准。

2 主要材料

碘海醇、N-ω硝基-L-精氨酸甲酯购于MedChem-Express；吲哚美辛购于北京索莱宝科技有限公司；EMPA购于上海源叶生物科技有限公司；TUNEL试剂盒购于广州锐博生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 实验分组及处理将40只SPF级6～8周龄雄性SD大鼠随机分配为对照（control）组、EMPA组、CA-AKI组和CA-AKI+EMPA组。所有大鼠均在标准条件下饲养，条件为12/12 h明暗循环，湿度为50%～60%，温度为22～24℃，并提供食物和水，适应性喂养1周。Control组大鼠适应性喂养1周后连续7 d予以生理盐水（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；EMPA组大鼠适应性喂养1周后连续7 d予以恩格列净（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃；CA-AKI组大鼠禁水16 h，参照前期方法［5-6］建立CA-AKI模型：首先于尾静脉注射吲哚美辛（10 mg/kg），其次分别于吲哚美辛注射后15 min和30 min经尾静脉注射N-ω硝基-L-精氨酸甲酯（10 mg/kg）和碘海醇（3g I/kg）；EMPA+CA-AKI组适应性喂养1周后连续7 d予以恩格列净（1.5 mg·kg-1·d-1）灌胃，禁水16 h后，余处理同CA-AKI组造模方式。同时予以足够的食物及饮水喂养，注射碘海醇后12 h进行安乐死，经内眦静脉丛采取血液及摘取双肾脏。

3.2 肾功能检测验证CA-AKI模型稳定性经内眦静脉丛收集各组血液，静置20 min，2 464×g离心20 min，收集上层血清。按照试剂盒说明进行血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）及肌酐清除率（creatinine clearance rate，CLCR）水平检测，CAAKI定义为SCr高于基线值25%［7］。

3.3 肾脏组织HE染色4%多聚甲醛固定肾脏组织，脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡，苏木精、伊红染色，脱水封片，于显微镜下观察各组肾脏组织病理改变情况，并进行图像采集。病理学变化主要包括：肾小管上皮细胞肿胀、管间出血、刷状缘丢失、细胞质空泡变性等。随机选取10个髓质部视野，根据评分标准进行评分（0～4分）［8］：0分：无肾小管损伤；1分：受损肾小管小于20%；2分：受损肾小管为21%～50%；3分：受损肾小管＞50%；4分：所有上皮细胞完全破坏。

3.4 肾脏组织TUNEL染色固定各组肾脏组织经全自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片、脱蜡，于超纯水中浸泡5 min；柠檬酸微波修复8 min，PBS洗3次，每次5 min；暗处配制TUNEL荧光孵育液于37℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；加DAPI染核15 min，PBS冲洗；甘油明胶封片，扫描并采集图像，每张切片先于100倍下观察全部组织，再于400倍视野下采集图像，并进行凋亡细胞分析，计算细胞凋亡率。

3.5 Western blot分析取各组肾脏组织50 mg，加入1 mL裂解缓冲液，充分碾磨，并于冰上裂解30 min，将其吸入至EP管中，于4℃、12 000×g条件下离心30 min，使用蛋白质定量试剂盒对蛋白质浓度进行定量。将各组蛋白分别加入电泳道中，通过10%SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后将其转移到PVDF膜上，5% BSA溶液封闭1 h，按照β-actin（1∶5 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、caspase-3（1∶1 000）、细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C；1∶1 000）分别稀释Ⅰ抗孵育，4℃过夜。次日复温30 min，TBST洗膜30 min，Ⅱ抗孵育1 h，再行TBST洗膜30 min，于发光液下显影，Image J软件进行统计分析。

3.6 免疫组织化学染色石蜡包埋后切片、脱蜡至水，将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（PH 6.0），微波炉高火加热10 min进行抗原修复，放入3%双氧水，室温10 min阻断内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液封闭20 min，滴加Ⅰ抗，4℃过夜后PBS洗涤，滴加Ⅱ抗，37℃孵育30 min后再次PBS洗涤，滴加DAB显色液，室温显色，然后蒸馏水洗涤切片，终止显色。经苏木素复染3 min，中性树胶封片，采集图像，分析数据。

3.7 氧化应激指标检测取适量血清标本，按照试剂盒说明书分别检测MDA含量及SOD和GSH-Px活性。使用分光光度仪分别检测波长为450 nm、532 nm、600 nm、560 nm、412 nm处的吸光度（A）值，并进行数据统计分析。

4 统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行统计分析，所有计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示，两组之间的差异通过t检验进行评估，多组之间通过单因素方差分析进行比较。以P＜0.05为有差异统计学意义。

结 果

1 大鼠CA-AKI模型的建立

分别于不同时点（造影剂注射前及造影剂注射后6 h、12 h和24 h）检测大鼠SCr、BUN、Cys-C和CLCR的水平。大鼠SCr、Cys-C和BUN水平在造影剂注射后逐渐升高，于造影剂注射12 h后达到高峰，后逐渐下降，CLCR在造影剂注射后逐渐下降，于造影剂注射后12 h后达到最低，后逐渐升高，见图1。HE染色结果显示，肾小管病理损伤程度于造影剂注射后逐渐加重，于造影剂注射12 h后病理损伤明显，出现肾小囊腔扩张，肾小球萎缩坏死，肾小管弥漫性脂肪变性、扩张，局部间质血管、肾小球毛细血管充血、淤血等现象，见图2。

Figure 1.Effect of contrast medium on renal function in rats.The levels of SCr（A），BUN（B），Cys-C（C）and CLCR（D）before and after injected with contrast medium at different time points（0，6，12 and 24 h）in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs 0 h group.图1 造影剂对大鼠肾脏功能的影响

2 恩格列净对大鼠CA-AKI的影响

与CA-AKI组比较，恩格列净干预后，大鼠血清SCr，BUN和Cys-C水平下降（P＜0.05），CLCR水平上升（P＜0.01），见图3。HE染色显示：与CA-AKI组比较，恩格列净干预后，肾小管病理损伤评分显著降低（P＜0.01），见图4。

3 恩格列净对大鼠肾脏细胞凋亡的影响

通过TUNEL染色观察肾脏细胞凋亡情况显示，造影剂注射引起大鼠肾脏细胞凋亡显著增加（P＜0.01）；与CA-AKI组比较，恩格列净干预后，大鼠肾脏细胞凋亡率显著下降（P＜0.01），见图5。进一步通过Western blot和免疫组化染色检测凋亡相关蛋白的表达，结果显示，造影剂注射后导致大鼠肾脏促凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax和Cyt-C）表达上调（P＜0.05）；而恩格列净可显著降低大鼠肾脏促凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax和Cyt-C）的表达，并上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（P＜0.01），见图6、7。

Figure 2.Effect of contrast medium on renal pathological damage in rats（HE staining，scale bar=20µm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs 0 h group.图2 造影剂对大鼠肾脏的病理损伤

Figure 3.Effect of empagliflozin（EMPA）on renal function in rats.The levels of SCr（A），BUN（B），Cys-C（C）and CLCR（D）with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CA-AKI group.图3 恩格列净对大鼠CA-AKI肾功能的影响

Figure 4.Effect of empagliflozin（EMPA）on contrast-induced renal pathological damage in rats（HE staining，scale bar=20µm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.图4 恩格列净对大鼠肾小管病理损伤的影响

Figure 5.Effect of empagliflozin（EMPA）on contrast-induced renal cell apoptosis in rats（TUNEL staining，scale bar=20µm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.图5 TUNEL染色分析恩格列净对大鼠肾脏细胞凋亡的影响

Figure 6.Effects of empagliflozin（EMPA）on apoptosis-related proteins（Bax，Cyt-C，caspase-3 and Bcl-2）in kidneys detected by Western blot.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.图6 恩格列净对肾脏组织凋亡相关蛋白表达的影响

4 恩格列净对大鼠肾脏氧化应激的影响

通过相应试剂盒检测SOD、GSH-Px活性和MDA含量评估大鼠肾脏的氧化应激情况，造影剂注射引起大鼠肾脏组织MDA水平显著增加、SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.01）；与CA-AKI组比较，恩格列净显著增加大鼠肾脏SOD和GSH-Px活性，并降低MDA水平（P＜0.01），见图8。

Figure 7.Immunohistochemical staining detection of renal apoptosis-related proteins（scale bar=40µm）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.图7 肾脏组织凋亡相关蛋白的免疫组织化学染色情况

Figure 8.Effect of empagliflozin（EMPA）on renal oxidative stress in rats.The SOD activity（A），GSH-Px activity（B）and MDA content（C）with different treatments in the rats.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CA-AKI group.图8 恩格列净对大鼠肾脏氧化应激的影响

讨 论

随着心血管介入技术的普及和介入手术量的日益增多，CA-AKI成为临床常见问题，发生于诊断和介入程序中血管内注射造影剂后，研究显示，在PCI治疗患者中CA-AKI发生率可达10%～25%，尤其以糖尿病合并冠心病患者为主［9］。既往研究提示CAAKI的发生可能与氧化应激、肾小管上皮细胞凋亡相关，但CA-AKI发生的具体机制尚未完全阐明。目前临床实践指南推荐水化作为预防CA-AKI的基础，然而，预防性水化治疗在保护肾功能方面的有效性还没有得到充分研究证据，同时N-乙酰半胱氨酸、他汀类药物等干预措施的有效性同样存在一定争议。因此，需寻找有效的预防和治疗CA-AKI的药物。

SGLT-2i可降低心衰患者住院率和心血管患者死亡率，目前广泛应用于糖尿病和心血管疾病的治疗［10-11］。课题组前期实验提示，SGLT-2i可能通过抑制氧化应激和心肌炎症反应，改善心肌重构，从而发挥心血管保护作用［12］。恩格列净作为SGLT-2i类药物，作用于SGLT-2受体的MAP17亚基，形成SGLT2-MAP17复合物，改变细胞膜电位差，保护肾小管上皮细胞，降低糖尿病患者的肾脏损伤［13］。然而，恩格列净能否减轻造影剂对肾脏的损伤，目前尚无相关研究。

本实验通过建立大鼠CA-AKI模型证实，恩格列净可通过抑制氧化应激和细胞凋亡，降低CA-AKI的发生。氧化应激导致肾小管上皮细胞氧自由基生成增加和清除能力下降，使氧自由基蓄积于细胞内，引起细胞氧化障碍，导致肾小管上皮细胞损害或凋亡，进而发生CA-AKI。研究证实，Nrf2介导的氧化应激可加重造影剂对小鼠肾脏的损害[14]。本研究中，恩格列净可使大鼠血清MDA含量下降，SOD和GSH-Px活性增加，提示恩格列净可能通过抑制氧化应激进而减轻肾脏损伤。既往相关研究证实，CaMKⅡ/NFAT通路激活可促进肾小管上皮上皮细胞凋亡[15]。本实验还观察到，恩格列净干预后，TUNEL染色提示肾脏细胞凋亡率较造影剂组显著下降，同时肾脏促凋亡蛋白caspase-3、Bax和Cyt-C表达减少、抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著增加，提示恩格列净可能通过抑制细胞凋亡来防治CA-AKI的发生发展。

综上，恩格列净可能通过抑制细胞凋亡和氧化应激，减轻造影剂对大鼠肾脏的损伤，从而预防CAAKI的发生发展。然而，由于本研究对象为SD大鼠，与临床患者有一定差异，需要临床试验进一步验证恩格列净对造影剂相关急性肾损伤的防治作用。此外，恩格列净是如何调节肾脏细胞凋亡和氧化应激途径的，我们将在进一步实验中探讨。