NRG1基因修饰的大鼠BMSCs对体外氧糖剥夺/复氧损伤少突胶质细胞的保护作用*

赵富生，陈君，杨国宏，符禹玄，张可心，李媛媛，武庚

（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157000）

脑卒中又称中风，是一种常见的急性脑血管疾病。在我国每年约150万～200万病人死于脑血管疾病，死亡率为149.49/10万人，其中大约80%为缺血性脑卒中［1］。脑缺血/再灌注损伤是缺血性脑卒中的关键环节，其病理机制与氧化应激、炎症和兴奋性毒性等因素有关［2］。少突胶质细胞是脑白质的重要组成细胞，对神经元具有支持、营养、保护和形成髓鞘等多种功能，对低灌注非常敏感，极易发生缺血缺氧损伤［3］。因此，探寻有效的干预措施阻止或改善缺血/再灌注导致的少突胶质细胞损伤具有重大意义。

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的非造血干细胞，具有取材方便，易于扩增，分泌包括外泌体在内的多种细胞因子，并能稳定表达外源基因等优点，因而被用于修复缺血性损伤和组织缺损［4-5］。在脑卒中大鼠模型中，通过尾静脉注射BMSCs可减轻血脑屏障渗漏，促进血管形成，减小脑梗死面积，改善大鼠神经功能［6］。经腹主动脉移植BMSCs可通过增加损伤部位血管内皮生长因子含量，进而介导其下游磷脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信号通路促进脊髓缺血再灌注损伤大鼠后肢功能恢复［7］。PI3K/AKT信号通路在细胞增殖、分化、迁移、凋亡及炎症反应等多种病理生理过程中发挥重要调节作用［8］。有研究报道，神经调节蛋白1（neuregulin 1，NRG1）通过激活PI3K/AKT通路减轻脓毒症引起的大鼠膈肌萎缩［9］。体外研究显示，NRG1通过激活PI3K/AKT通路促进耳蜗核神经干细胞向神经元和神经胶质细胞分化，抑制细胞凋亡［10］。NRG1是一种含表皮生长因子样结构域的跨膜蛋白，参与神经细胞发育、髓鞘形成、突触塑型以及神经受体表达，在神经系统发育过程中发挥重要作用［11］。研究表明，NRG1通过与其受体ErbB2、ErbB3和ErbB4结合，形成同源或异二聚体，激活细胞内酪氨酸激酶，参与调控少突胶质细胞增殖和分化［12］。有研究报道，鞘内注射NRG1蛋白能够减轻炎症反应，减少硫酸软骨素聚糖蛋白生成，抑制胶质瘢痕形成，促进大鼠神经功能恢复［13］。将NRG1基因过表达的脂肪基质干细胞注射到大鼠纹状体，可通过NRG1-ErbB4通路促进MAPK磷酸化，减小脑梗死面积，改善脑卒中大鼠神经功能［14］。我们的前期研究表明，NRG1基因过表达施万细胞通过上调ErbB2和ErbB4表达，促进神经元存活，改善脊髓损伤大鼠肢体运动功能［15］。然而，上调BMSCs中NRG1的表达，能否提升BMSCs对氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）所致少突胶质细胞损伤的保护作用，目前尚未见报道。因此，本研究拟构建少突胶质细胞OGD/R模型，体外观察NRG1基因修饰的大鼠BMSCs对少突胶质细胞OGD/R损伤的保护作用，并探讨其可能机制，旨在为脑卒中治疗提供参考资料。

材料和方法

1 材料

1.1 动物1月龄SPF级SD大鼠6只，雌雄各半，体重90～100 g，由牡丹江医学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK（黑）2019-003。

1.2 细胞大鼠少突胶质前体细胞系CG4购自上海淳麦生物科技有限公司。

1.3 主要试剂与仪器pcDNA3.1（+）-NRG1-IRES/eGFP质粒（广州赛业生物科技有限公司）；Transwell（Corning）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；二氢乙啶（dihydroethidium，DHE）、calcein/PI染色试剂盒、衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）染色试剂盒和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）；Fu-Gene6转染试剂（Promega）；抗p21、p53、PI3K和AKT抗体（Proteintech）；抗p-PI3K和p-AKT抗体（Abcam）。ELx800酶标仪（BioTek）；激光共聚焦显微镜（Nikon）；MIC-101细胞缺氧气室（Billups-rothenberg）。

2 方法

2.1 BMSCs分离培养颈椎脱臼处死大鼠，在无菌条件下分离股骨和胫骨，用10 mL DMEM冲洗骨髓腔，经200目无菌筛网过滤冲洗液，接种于50 mL培养瓶中，常规培养72 h后更换培养液，当细胞汇合达80%～90%时，进行传代培养［16］。

2.2 NRG1质粒转染BMSCs取第3代BMSCs按1×108/L、每孔2 mL接种于6孔板中，分为对照（BMSCs）组、空质粒转染BMSCs（empty vector-BMSCs）组和NRG1质粒转染BMSCs（NRG1-BMSCs）组。按照Fu-Gene6转染试剂说明书用NRG1质粒和空载质粒分别转染BMSCs，具体操作参照文献进行［13］。转染24 h和72 h，收集各组BMSCs，按照ELISA试剂盒说明测定各组细胞裂解液和培养液中NRG1蛋白含量。

2.3 OGD/R模型建立和实验分组取CG4细胞更换无糖DMEM培养液，置于缺氧培养气室中，通入混合气体（95%N2和5%CO2）37℃培养2 h，更换完全培养液，37℃、5% CO2培养箱中复氧复糖培养22 h，建立OGD/R细胞模型［17］。BMSCs（1.5×108/L）或NRG1-BMSCs（1.5×108/L，转染72 h）与OGD/R处理CG4细胞（1.5×108/L）在Transwell中共培养。将实验分为4组：对照（control）组，CG4细胞常规培养24 h；OGD/R组，OGD/R处理CG4细胞后，常规培养24 h；BMSCs组，OGD/R处理CG4细胞后，与BMSCs常规共培养24 h；NRG1-BMSCs组，OGD/R处理CG4细胞后，与NRG1-BMSCs常规共培养24 h，进行后续实验。采用倒置相差显微镜观察CG4细胞形态学变化。

2.4 MTT实验取各组CG4细胞，以3×107/L接种于96孔培养板，每孔100µL，培养24 h，加MTT工作液（每孔10µL），孵育4 h后弃培养液，加100µL DMSO，酶标仪在570 nm波长处测定吸光度（A）。细胞活力（%）=（样品平均A值-空白孔平均A值）/（对照组平均A值-空白孔平均A值）×100%。

2.5 细胞划痕实验取各组CG4细胞，以5×108/L接种于6孔培养板，培养24 h，用20µL吸头垂直于培养皿底部水平划痕（0 h），继续培养24 h，显微镜下观察细胞分布并采集图像。采用ImageJ软件测量划痕面积，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

2.6 氧化应激检测取各组CG4细胞，应用DHE荧光探针检测各组CG4细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，采用硫代巴比妥酸法测定CG4细胞裂解液中MDA含量，通过比色法检测CG4细胞内总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）水平，实验操作均按照试剂盒说明书进行。

2.7 细胞衰老检测取各组CG4细胞，室温固定，加1 500µL SA-β-Gal染色工作液，光镜下观察拍照。各组随机选取6个视野，计算阳性细胞率并求均值。阳性细胞率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.8 细胞死亡率检测参照文献［18］，采用calcein/PI双染法检测细胞存活情况。红色荧光代表PI染色细胞，为死亡细胞，绿色荧光代表calcein染色细胞，为存活细胞。取各组CG4细胞，接种于铺有玻片6孔培养板，培养24 h，加calcein/PI染色工作液，37℃避光孵育30 min，收集CG4细胞玻片，激光共聚焦显微镜采集图像。采用ImageJ分析细胞死亡率。细胞死亡率（%）=PI阳性细胞数/（calcein阳性细胞数+PI阳性细胞数）×100%。

2.9 LDH漏出率检测参照文献［19］操作。取各组CG4细胞，接种于96孔板中，对照组选取6孔加20µL LDH，作为样品细胞最大酶活性对照孔，其它各组每孔加20µL细胞培养液，常规培养1 h。收集各组CG4细胞培养液离心，取120µL上清液加入到新的96孔板中，各孔加60µL LDH工作液，室温孵育30 min，酶标仪在490 nm处测定A值。LDH漏出率（%）=（处理样品A值-空白孔平均A值）/（细胞最大酶活性A值-空白孔平均A值）×100%。

2.1 0 Western blot检测蛋白表达收集各组CG4细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，使用BCA法测定蛋白质浓度，变性后每孔加等量蛋白（30µg），进行凝胶电泳和转膜。然后将PVDF膜置于5% BSA中封闭2 h，加入β-actin、衰老相关蛋白（p21和p53）和PI3K/AKT通路蛋白（p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT）抗体（均以1∶1 000的比例稀释），4℃孵育过夜。次日加相应Ⅱ抗，37℃孵育2 h，加ECL发光试剂显影成像，用ImageJ软件参照β-actin分析目的蛋白条带相对灰度值，计算目的蛋白质相对表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，结果以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），采用SNK-q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BMSCs培养及NRG1质粒转染BMSCs

细胞培养第1天，倒置相差显微镜下观察BMSCs呈球形、漂浮未贴壁，分布均匀；培养第3～5天，BMSCs呈多角形或长梭形，贴壁生长，形成多个散在细胞集落；传代培养后，BMSCs排列紧密，呈束状生长（图1A～C）。BMSCs转染NRG1质粒后呈现明亮绿色荧光（图1D～F）。ELISA结果显示，与BMSCs组相比，NRG1-BMSCs组培养液上清和细胞裂解液中NRG1蛋白含量在转染72 h均显著升高（P＜0.05），见图1G、H。

Figure 1.Rat BMSCs culture and NRG1 plasmid transfection in BMSCs.A and B：morphological changes of primary BMSCs on the 1st and 3rd days observed under inverted microscope；C：morphological changes of BMSCs in the 3rd generation observed under light microscope；D and E：BMSCs transfected with pcDNA3.1（+）-NRG1-IRES/eGFP plasmid were observed under inverted and fluorescence microscope，respectively；F：overlay of light microscope image and fluorescence image（green）of NRG1-BMSCs；G and H：comparison of NRG1 protein content in culture medium and cell lysate of the BMSCs，empty vector-BMSCs and NRG1-BMSCs groups.Scale bar=200µm in A，B and C；scale bar=100µm in D，E and F.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs BMSCs group；#P＜0.05 vs empty vector-BMSCs group.图1 大鼠BMSCs培养及NRG1质粒转染BMSCs

2 NRG1-BMSCs对OGD/R引起的CG4细胞形态变化及活力的影响

建立CG4细胞OGD/R模型，实验分组见图2A。各组CG4细胞形态变化如图2B所示，control组CG4细胞胞体透亮，呈梭形或三角形，突起细长；OGD/R组CG4细胞肿胀，胞体变暗，胞突减少；与NRG1-BMSCs共培养后，CG4细胞肿胀明显减轻，漂浮细胞减少，细胞突起增多。MTT结果如图2C所示，与control组相比，OGD/R组CG4细胞活力显著降低（P＜0.01）；与OGD/R组相比，NRG1-BMSCs组CG4细胞活力显著升高（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.01）；BMSCs组与OGD/R组相比，细胞活力有所升高，但未见显著差异（P＞0.05）。

Figure 2.Effects of NRG1-BMSCs on the morphological changes and viability of CG4 cells induced by OGD/R.A：schematic diagram of experimental grouping；B：the morphological changes of CG4 cells observed under light microscope（scale bar=100µm）；C：comparison of CG4 cell viability in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图2 NRG1-BMSCs对OGD/R引起的CG4细胞形态变化及活力的影响

3 NRG1-BMSCs对OGD/R导致的CG4细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果如图3所示，与control组相比，OGD/R组CG4细胞划痕愈合率显著降低（P＜0.01）；与OGD/R组相比，NRG1-BMSCs组划痕两侧细胞密度增大，空白面积明显减少，划痕愈合率显著增加（P＜0.01），但仍低于对照组（P＜0.01）；BMSCs组与OGD/R组相比，划痕愈合率增加，但未见显著性差异（P＞0.05）。

Figure 3.Effects of NRG1-BMSCs on the migration of CG4 cells induced by OGD/R.Wound healing assay was performed，and the healing rate of the CG4 cells at 24 h in each group was determined.Scale bar=200µm.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图3 NRG1-BMSCs对OGD/R导致的CG4细胞迁移能力变化的影响

4 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞氧化应激的影响

细胞氧化应激检测如图4所示，与control组相比，OGD/R组CG4细胞内ROS和MDA含量显著升高（P＜0.01），而T-AOC水平显著降低（P＜0.01）；与OGD/R组相比，NRG1-BMSCs组CG4细胞内ROS和MDA含量显著降低（P＜0.01），T-AOC水平显著升高（P＜0.05），但未恢复到control组水平（P＜0.05）；BMSCs组与OGD/R组相比ROS、MDA和T-AOC水平均未见显著性差异（P＞0.05）。

Figure 4.Effects of NRG1-BMSCs on oxidative stress in CG4 cells induced by OGD/R.A：representative DHE fluorescence staining images of CG4 cells in each group（red represented ROS，and blue represented nuclei stained with DAPI；scale bar=100µm）；B：quantitative analysis of DHE fluorescence intensity in each group；C and D：quantitative analysis of MDA content and T-AOC level in CG4 cells of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.图4 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞氧化应激的影响

5 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞衰老的影响

细胞衰老检测如图5所示，与control组相比，ODG/R组CG4细胞衰老阳性率及衰老相关蛋白p21和p53水平均显著升高（P＜0.01）；与OGD/R组相比，NRG1-BMSCs组衰老细胞阳性率及p21和p53蛋白水平显著降低（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.05）；BMSCs组与OGD/R组相比，CG4细胞衰老阳性率及p21和p53蛋白水平有所降低，但未见显著差异（P＞0.05）。

6 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞死亡的影响

细胞死亡检测如图6A、B所示，与control组相比，OGD/R组PI阳性细胞显著增多（P＜0.01）；与OGD/R组比，NRG1-BMSCs组PI阳性细胞显著减少（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.01）。LDH漏出率检测如图6C所示，与control组相比，ODG/R组CG4细胞LDH漏出率显著增加（P＜0.01）；与OGD/R组相比，NRG1-BMSCs组CG4细胞LDH漏出率显著降低（P＜0.01），但未恢复到control组水平（P＜0.01）。

Figure 5.Effects of NRG1-BMSCs on CG4 cell senescence induced by OGD/R.A：representative SA-β-Gal staining images of CG4 cells in each group（scale bar=100µm）；B：quantitative analysis of SA-β-Gal positive rate of CG4 cells in each group；C and D：the protein expression levels of p21 and p53 in CG4 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图5 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞衰老的影响

7 NRG1-BMSCs对OGD/R诱 导 的CG4细 胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响

与control组 相 比，OGD/R组CG4细 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比 值 显 著 降 低（P＜0.01）；与OGD/R组比，NRG1-BMSCs组CG4细胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值显著升高（P＜0.01），但仍未恢复到control组水平（P＜0.01）；BMSCs组与OGD/R组相比，CG4细胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值略有升高，但未见显著性差异（P＞0.05），见图7。

讨 论

OGD/R细胞模型模拟了脑卒中的部分病理变化过程，是构建脑缺血/再灌注体外模型的常用方法［20］。本研究采用CG4细胞建立OGD/R模型模拟脑卒中后少突胶质细胞损伤，体外探讨NRG1基因修饰的大鼠BMSCs对OGD/R导致的少突胶质细胞损伤的保护作用，结果显示NRG1-BMSCs能够抑制OGD/R诱导的少突胶质细胞衰老以及死亡，其作用机制可能与调节PI3K/AKT信号通路，减轻细胞氧化应激有关。据我们所知，这项研究首次明确了NRG1基因修饰的大鼠BMSCs对少突胶质细胞OGD/R损伤的保护作用并提出了可能的保护机制。

NRG1在神经元迁移、胶质细胞发育以及神经元和胶质细胞联系过程中发挥重要作用［21］。本研究通过全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，荧光显微镜观察可见NRG1质粒成功转染BMSCs。在NRG1-BMSCs培养液和细胞裂解液中，NRG1蛋白水平显著升高且呈现时间依赖性增加。该结果提示，将NRG1-BMSCs移植到脑缺血区可能增加局部NRG1含量，一定程度上改善损伤局部微环境，促进受损神经修复。

有研究报道，BMSCs培养液通过激活PI3K/AKT信号通路减轻OGD/R导致的离体皮层神经元损伤，抑制caspase-3蛋白表达，提高神经元存活率，发挥神经保护作用［22］。本研究将NRG1-BMSCs与OGD/R处理后的CG4细胞共培养，结果表明NRG1-BMSCs能够显著提高CG4细胞的活力和迁移能力，提示NRG1能够提升BMSCs对CG4细胞OGD/R损伤的保护作用。有研究报道，缺氧预处理的BMSCs可通过NRG1/PI3K/AKT信号通路促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移以及血管生成［23］。研究表明，将BMSCs与髓核细胞三维共培养可提高髓核细胞增殖活性，抑制β-半乳糖苷酶以及基质金属蛋白酶9表达，减轻TNF-α诱导的髓核细胞衰老［24］。本研究结果显示，OGD/R引起CG4细胞衰老，也可破坏CG4细胞膜导致LDH外漏，诱发CG4细胞死亡。然而，NRG1-BMSCs能够减轻OGD/R引起的细胞膜破坏，抑制CG4细胞死亡。此外，NRG1-BMSCs能够抑制OGD/R介导的衰老相关蛋白p21和p53表达，延缓OGD/R诱导的CG4细胞衰老和死亡。我们推测，NRG1-BMSCs神经保护作用可能与减轻OGD/R诱发的CG4细胞氧化应激有关。

Figure 6.Effects of NRG1-BMSCs on the death of CG4 cells induced by OGD/R.A：representative calcein/PI fluorescence staining images of CG4 cells in each group（red represented dead cells stained with PI，and green represented live cells stained with calcein；scale bar=100µm）；B：quantitative analysis of PI positive CG4 cells in each group；C：LDH leakage rate of CG4 cells in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图6 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞死亡的影响

研究表明，脑缺血再灌注过程中产生大量氧自由基，诱发一系列细胞反应，如线粒体损伤、脂质过氧化、细胞衰老和凋亡［25］。因此，如何有效抑制氧化应激被认为是防治OGD/R诱发脑损伤潜在的靶点。有研究报道，小檗碱预处理的BMSCs分泌液能抑制过氧化叔丁醇诱导的ROS生成，减轻氧化应激导致的离体神经元凋亡［26］。在本研究中，我们检测了CG4细胞内ROS水平和脂质过氧化产物MDA含量，结果显示OGD/R导致CG4细胞中ROS和MDA含量显著增加，NRG1-BMSCs能够减少OGD/R引起的ROS过量产生和MDA积累。该结果提示，NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的氧化应激和脂质过氧化损伤具有一定的抑制作用。此外，本研究表明，NRG1-BMSCs能够恢复OGD/R处理后CG4细胞内T-AOC含量。这些研究结果提示，NRG1-BMSCs能够减轻OGD/R导致的CG4细胞氧化应激，抑制ROS引起的CG4细胞衰老和死亡。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，激活后与AKT蛋白结合，通过调节下游蛋白，参与细胞存活、生长及凋亡［27］。有研究报道，NRG1通过激活PI3K/AKT信号通路减轻脓毒症引起的氧化应激和炎症反应，改善大鼠膈肌功能［28］。本研究结果显示，OGD/R抑制CG4细胞内p-PI3K和p-AKT蛋白表达。我们认为OGD/R引起的氧化应激可能抑制细胞内PI3K/AKT通路磷酸化。然而，NRG1-BMSCs能够提高OGD/R处理后CG4细胞内PI3K和AKT磷酸化水平。因此，本研究认为PI3K/AKT信号通路参与调控OGD/R诱导的CG4细胞衰老及死亡，NRG1-BMSCs对CG4细胞的保护作用可能与PI3K/AKT信号通相关。

Figure 7.Effects of NRG1-BMSCs on the expression of PI3K/AKT signaling pathway-related proteins in CG4 cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图7 NRG1-BMSCs对OGD/R诱导的CG4细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

综上所述，NRG1-BMSCs能够抑制OGD/R诱导的CG4细胞衰老和死亡，其保护作用可能与调节PI3K/AKT信号通路，减轻细胞氧化应激有关。本研究为脑卒中治疗提供了新的实验依据，但目前研究结果均为体外研究，下一步将采用动物模型深入探究NRG1-BMSCs对OGD/R损伤的修复机制。