阿尔茨海默病合并2型糖尿病大鼠模型构建及病理改变的初步评价*

于文静，杨苗，贺春香，金怡杰，李泽，李平，邓思思，成绍武，宋祯彦

（湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以进行性认知功能障碍和学习记忆能力减退为主的神经退行性疾病，研究显示，糖代谢紊乱与AD的发生发展关系密切，是重要的危险因素之一［1］。流行病学调查表明，80%的AD患者患有糖尿病或有糖耐量方面的损伤，而2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）使阿尔茨海默病发生的概率增加了1.5～2.5倍，后期并发认知功能障碍的概率较非糖尿病患者更高，并逐渐发展为散发型AD［2-3］。目前已有研究表明，通过注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）构建的T2DM大鼠模型的海马和皮质中有β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）表达的增加及认知功能的障碍［4］，T2DM小鼠模型跳台实验中学习记忆能力有所下降，且脑内核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表达明显增加［5］。因此，AD合并有T2DM病理改变的模型在探究AD病理机制及T2DM病理改变的过程中更为贴近疾病发生发展的规律，AD动物模型和T2DM动物模型都有成熟的构建方式，而AD合并T2DM动物模型的发展尚在探寻过程中。本项工作通过对SD大鼠进行高脂食糜灌胃，STZ腹腔及侧脑室注射，观察不同模型的血糖血脂及胰岛素的改变，焦虑抑郁和学习记忆能力的变化，脑内海马区病理变化和炎症反应，探究AD合并T2DM动物模型的构建过程及AD和T2DM发病之间的联系，为AD的防治提供实验数据。

材料和方法

1 动物

40只SPF级雄性SD大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体质量180～200 g，周龄6～8周，动物许可证号码：SCXK（湘）2019-0004，由湖南中医药大学动物实验中心提供SPF级屏障系统，温度（25±2）℃，由标准大鼠饲料和水进行饲养，12 h光照黑暗周期，动物实验过程均符合伦理学要求，伦理审批号：202105100001。

2 主要试剂及仪器

STZ（S0130）购自Sigma-Aldrich；血糖试纸（EA-11）购自三诺生物传感股份有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG；A110-1-1）、总胆固醇（total cholesterol，TC；A111-1-1）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C；A112-1-1）及低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C；A113-1-1）检测试剂盒购自南京建成有限公司；胰岛素ELISA试剂盒（E-EL-R3034）购自伊莱瑞特公司；荧光II抗（A21206，A32849）和TRIzol Reagent（15596018）购 自Invitrogen；Iba1抗 体（011-27991）购自Wako；GFAP抗体（bs-0199R）购自北京博奥森生物科技有限公司；逆转录试剂盒（0521751）购自近岸蛋白科技股份有限公司；SYBR Green预混液（MQ00401）购自上海莫纳生物科技有限公司；TNF-α、IL-6和IL-1β引物合成于上海生工生物工程有限公司，突触素I（synapsin I）抗体（ab254349）和突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）抗 体（ab18258）购自Abcam；β-actin抗体（AF7018）购自Affinity Biosciences。

CytationTM3型多功能酶标仪（BioTek）；Tissue-FAXS Plus全景组织细胞定量分析系统（TissueGnostics）；低温高速离心机（Thermo Fisher）；CFX96 Touch荧光定量PCR仪和ChemiDoc XRS+化学发光凝胶成像仪（Bio-Rad）；SMART 3.0小动物行为学记录分析系统（瑞沃德生命科技有限公司）。

3 主要方法

3.1 T2DM大鼠模型构建［6］适应性喂养大鼠7 d后，随机选择20只大鼠进行高脂食糜灌胃（10 mL·kg-1·d-1），成分为20%猪油、20%吐温80、20%丙二醇、10%胆固醇、2%胆酸钠和0.2%丙基硫氧嘧啶［7］，灌胃后第14天进行STZ（柠檬酸缓冲液配制1% STZ注射液；25 mg/kg［8］）腹腔注射，剩余20只灌胃等体积生理盐水及腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，注射后7 d测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），观察造模是否成功，FPG≥16.7 mmol/L为造模成功，常规喂养1周。

3.2 AD大鼠模型构建300µL柠檬酸缓冲液配21.6 mg STZ（72 g/L）注射液，STZ腹腔注射后随机选择10只T2DM模型大鼠和10只未造模大鼠，第14天进行双侧侧脑室脑立体定位注射STZ，根据《大鼠脑立体定位图谱》（第6版），每只大鼠按照2.4 mg/kg［9］最高注射体积不超过10µL，剩余20只注射等体积柠檬酸缓冲液。AD大鼠模型参考文献构建［10］，具体操作步骤如下：大鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，将大鼠的头固定于脑立体装置上，以前囟为起点，由前向后0.8 mm，距颅骨正中线左右移动1.5 mm，深度3.7 mm，注射速度为1µL/min，注射完毕后留针5 min，出针后用棉球按住止血，涂抹碘伏，缝合伤口将大鼠放回待其苏醒，观察行动无异常后放回。AD+T2DM模型10只死亡2只，死亡率为20%，存活率为80%；AD模型死亡1只，死亡率为10%，存活率为90%；T2DM模型死亡1只，死亡率为10%，存活率为90%。

3.3 实验分组依据造模过程，将40只大鼠分为假手术（sham）组、T2DM组、AD组和AD+T2DM组，每组10只。sham组：生理盐水灌胃，腹腔和侧脑室注射相对药剂等体积柠檬酸缓冲液；T2DM组：高脂食糜灌胃，腹腔注射STZ，侧脑室注射等体积柠檬酸缓冲液；AD组：生理盐水灌胃，腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液，侧脑室注射STZ；AD+T2DM组：高脂食糜灌胃，腹腔和侧脑室注射STZ。

3.4 旷场实验选取1 m×1 m旷场箱，四周用围帘遮住防止干扰，使用SMART 3.0小动物行为学记录分析系统对大鼠的行动轨迹进行追踪，将旷场分为周围区、中心区和中央区，将大鼠放入中央区后立即离开并记录行动轨迹，5 min后将大鼠捞出，喷洒酒精对旷场箱进行气味消除，放入下一只大鼠。记录的数据包括5 min内水平移动距离，进入中心区次数，中心区和周围区滞留时间，行动轨迹图，直立次数，修饰次数等。

3.5 Morris水迷宫实验选择直径为1.6 m的恒温游泳池，四周用围帘遮住，将大鼠提前一天放入水迷宫中自由游泳120 s提前适应。将水迷宫分成四个象限，每个象限筒壁上贴好醒目标志物，选择直径12 cm的平台放置在第一象限中心位置，加水至平台上1 cm，使用SMART 3.0小动物行为学记录分析系统对大鼠的行动轨迹进行追踪。（1）定位航行实验：实验前5 d，将大鼠分别从四个象限面朝筒壁放到水中，记录1 min内找到平台的时间和轨迹，1 min内找到平台，记录潜伏时间，若没有找到，则记录为60 s，并将其引导至平台上学习20 s。（2）空间探索实验：第6天撤去平台，将大鼠从平台象限对侧象限放入水中，记录穿梭平台次数和平台象限停留时间。

3.6 取材及保存按照体重使用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠四肢固定，U字形剪开腹腔，采血针于腹主动脉取血约3 mL每只，将预冷的50 mL生理盐水于左心室注入，剪开右心耳，注射至内脏发白代表心脏灌注成功，断头取脑，左脑固定于多聚甲醛中，右脑分为皮质和海马两部分，液氮冻存后转入-80℃冰箱。血液1 500×g离心15 min，取上层血浆，使用试剂盒检测胰岛素（insulin，INS）、TC、TG、LDLC、HDL-C等指标，计算胰岛素抵抗指数（HOMAIR）。HOMA-IR=FPG（mmol/L）×INS（mIU/L）/22.5。具体时间安排如图1所示。

Figure 1.Schematic representation of the experimental design.图1 实验设计流程

3.7 HE染色左半脑固定后石蜡包埋，石蜡切片机切成3µm厚度的切片，脱蜡复水后苏木精染色5 min，流水冲洗后0.5%盐酸乙醇分化1 min，PBS浸泡反蓝，伊红染色1 min，梯度脱水晾干，滴中性树胶进行封片，常温晾干。

3.8 尼氏染色石蜡切片，烘烤脱蜡后，1%甲苯胺蓝37℃浸染25 min，95 %乙醇分化30 s，梯度脱水，中性树胶封片，盖盖玻片。

3.9 免疫荧光染色检测海马区小胶质细胞和星形胶质细胞石蜡切片，65℃烘箱中1 h，二甲苯和乙醇脱蜡后进行3% H2O2灭活，PBS洗3次，5% BSA和0.3% Triton X-100封闭1 h，孵育Ⅰ抗Iba1（1∶50）和GFAP（1∶100）4℃湿盒过夜，PBS洗3次，荧光Ⅱ抗Alexa Fluor 647（1∶500）和488（1∶800）避光室温1 h，PBS洗后甩干滴加含DAPI的抗荧光淬灭剂，反应3 min后盖上盖玻片，避光保存，全景组织细胞定量分析系统扫描。

3.1 0 qPCR法检测炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达取大鼠右半脑的一半海马，TRIzol法提取海马组织RNA，测RNA浓度，按照1 000 ng每20µL逆转录成cDNA，使用SYBR染料法进行qPCR检测TNFα、IL-6和IL-1βmRNA表达水平，以β-actin为内参照，用2-ΔΔCt法计算各mRNA相对表达量，TNF-α、IL-6和IL-1β引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.1 1 Western blot法检测synapsin I和PSD95蛋白表达取大鼠右半脑的另一半海马，加入钢珠和含蛋白酶抑制剂的裂解液于低温组织破碎仪中破碎海马组织，离心取上清，用BCA试剂盒测定海马组织蛋白浓度，配上样缓冲液，于-20℃保存。电泳条件：80 V，30 min，120 V，90 min。0.45µm PVDF膜湿转200 mA，2 h；5%脱脂牛奶摇床封闭1 h，TBST冲洗净牛奶后孵育Ⅰ抗［synapsin I抗体（1∶1 000）、PSD95抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶8 000）］4℃过夜，TBST洗3次10 min，37℃孵育Ⅱ抗（1∶10 000）1 h，TBST洗3次10 min，ECL显影液于凝胶成像系统中显影成像，ImageJ软件分析图像。

4 统计学处理

使用SPSS 26.0进行统计学分析，制作统计图使用GraphPad Prism 8.0软件。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，采用单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AD合并T2DM大鼠模型血糖、血脂和胰岛素水平变化

与sham组相比，T2DM造模后大鼠的血糖有显著上升（P＜0.01）（图2A）；取材后对血浆进行检测，与sham组相比，T2DM组和AD+T2DM组的TC（P＜0.05）、TG（P＜0.05）和HOMA-IR（P＜0.01）升 高，LDL-C虽然有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），HDL-C和胰岛素减少（P＜0.05）；与AD组相比，AD+T2DM组TG和HOMA-IR升高（P＜0.01），HDL-C降低（P＜0.05），见图2B～G。

2 AD合并T2DM大鼠模型学习与记忆能力改变

Morris水迷宫结果显示（图3），与sham组相比，AD组、T2DM组和AD+T2DM组大鼠的学习记忆能力均有所下降，在定位航行实验中，实验第5天三组找到平台的时间均有增加（P＜0.05）；在空间探索实验中，撤去平台后，AD组和AD+T2DM组的穿梭平台次数及平台象限停留时间均显著减少，T2DM组平台穿梭次数减少（P＜0.01）。

旷场实验结果显示（图4），与sham组相比，AD+T2DM组水平移动总距离、进入中央区次数、中央区滞留时间、中央区/周围区滞留时间均有减少（P＜0.05），AD组直立次数和修饰次数都有减少（P＜0.05），与AD组相比，AD+T2DM组水平移动总距离、进入中央区次数减少（P＜0.05）。

3 AD合并T2DM大鼠模型海马区神经细胞病理形态的变化

对各组大鼠海马CA2区进行HE染色和尼氏染色，结果如图5所示。HE实验结果表明，sham组CA2区神经元细胞排列整齐，细胞核大圆且清晰，AD组和T2DM组的CA2区神经元细胞排列稍有紊乱，可见细胞的核深染、固缩，神经元有一定程度的损伤，AD+T2DM组细胞CA2区细胞排列紊乱，细胞核深染、固缩程度加深，神经元受损加重。

尼氏染色结果显示，sham组神经元细胞形态规则，大小和数量正常，排列整齐紧密，胞质内有均染的尼氏体；AD组和T2DM组神经元排列不规则，数量减少，细胞肿胀或皱缩，胞内尼氏体减少；AD+T2DM组神经元排列疏松，细胞呈空泡样改变或皱缩，数量减少明显，尼氏体减少，着色变浅，有散在的核溶解。

Figure 2.Fasting plasma glucose，insulin，HOMA-IR，TC，TG，LDL-C and HDL-C levels.Mean±SD.n=8.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs AD group.图2 各组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平

Figure 3.Learning and memory ability in each group tested by Morris water maze test.A：rat trajectory in Morris water maze test；B：mean escape latency on day 5；C：platform crossover；D：time in target quadrant.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group.图3 水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力变化

Figure 4.Activity of the rats detected by open-field test.A：rat trajectory in open-field test；B：total distance travelled；C：line crossing；D：time spent in open area；E：time spent in open/border area；F：rearing；G：grooming.Mean±SD.n=8.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs AD group.图4 各组大鼠在旷场实验中的活动情况

Figure 5.Pathological changes in hippocampal CA2 region observed by HE staining and Nissl staining.The scale bar=100µm.图5 HE染色和尼氏染色观察各组大鼠脑组织海马CA2区病理学变化

4 AD合并T2DM大鼠模型海马区小胶质细胞和星形胶质细胞的活化情况

免疫荧光染色结果显示（图6A），GFAP阳性表达为绿色荧光标记的星形胶质细胞，Iba1阳性表达红色标记的小胶质细胞，sham组小胶质细胞和星形胶质细胞少有活化，AD组、T2DM组、AD+T2DM组的小胶质细胞和星形胶质细胞均有活化，较sham组活化数量均显著增加（P＜0.05），且AD+T2DM组更为显著（P＜0.01），见图6B～C。

Figure 6.Activation of microglia and astrocytes in the hippocampus observed by immunofluorescence.A：immunofluorescence of GFAP（green，astrocytes）and Iba1（red，microglia）in each group（blue：DAPI positive singal；scale bar=20µm）；B and C：quantificaton of GFAP and Iba1 expression.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs AD group.图6 免疫荧光染色观察海马区小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况

5 AD合并T2DM大鼠模型海马区炎症因子的表达

通过qPCR结果显示（图7），与sham组对比，AD组和AD+T2DM组炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达均有显著升高（P＜0.05），T2DM组的炎症因子IL-6的mRNA表达显著增加（P＜0.01）。与AD组相比，AD+T2DM组IL-1β和IL-6的mRNA表达显著升高（P＜0.05）。

6 AD合并T2DM大鼠模型海马区突触蛋白synap-sin I和PSD95的表达

Western blot实验检测各组海马区突触蛋白PSD95和synapsin I的表达，与sham组相比，AD组和AD+T2DM组的突触蛋白PSD95（P＜0.01）和synapsin I（P＜0.05）表达水平降低，T2DM组PSD95表达水平降低（P＜0.01），synapsin I表达虽有下降，但差异无统计学意义，见图8。

Figure 7.Relative mRNA levels of TNF-α，IL-1βand IL-6 in the hippocampus detected by qPCR.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05 vs AD group.图7 各组大鼠海马区炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的相对mRNA水平

Figure 8.The protein levels of PSD95 and synapsin I in the hippocampus determined by Western blot.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group.图8 Western blot检测各组大鼠海马区突触蛋白synapsin I和PSD95的表达

讨 论

AD是一种常见的神经退行性疾病常伴有糖代谢紊乱，T2DM是导致认知功能障碍常见的危险因素之一。随着社会的发展，经济水平的提高，人们的饮食习惯发生了很大的改变，高饱和脂肪、糖、高动物蛋白而低纤维的饮食习惯，又称作西式饮食（WS饮食），正在成为流行［11-12］。这种饮食习惯不仅使糖尿病的发病人数不断增加，且缺乏重要的多酚、抗氧化剂和与大脑成熟相关的omega-3脂肪酸等，导致与海马相关的学习记忆能力的下降和认知功能的减退［13］。STZ可破坏胰岛β细胞，减少胰岛素的生成，常用作糖尿病模型。研究表明，低剂量STZ侧脑室注射可引起脑内胰岛素信号稳态被破坏以及能量代谢障碍，使大脑出现中Aβ沉积、tau过度磷酸化［14］、氧化应激、神经炎症［15］、突触功能障碍、胰岛素抵抗［16］等与散发型AD类似的病理学变化，出现学习和记忆功能受损及认知障碍［17］，因此侧脑室注射STZ是一种研究散发型AD病理机制的常见模型。本研究构建AD合并T2DM大鼠模型，有利于探究AD和T2DM之间的发病联系，进一步揭示AD的发生发展规律。

高血糖、胰岛素抵抗伴分泌不足和高血脂是T2DM的重要特征。本研究显示，通过高脂食糜灌胃和STZ腹腔注射能够引起SD大鼠和AD模型大鼠的生化指标发生改变，通过高脂食糜灌胃和STZ腹腔注射后对血糖的监测，显示造模后两周的血糖高达（25.24±5.13）mmol/L，符合标准。糖尿病可以发生糖脂代谢的紊乱，显著的胰岛素抵抗会引发脂质代谢异常，如血脂四项的改变，这与胰岛素在一定程度上可以促进脂蛋白分解有关。因此本研究对四组大鼠进行了血糖、胰岛素和血脂四项的检测，表明T2DM组和AD+T2DM组的空腹血糖升高，胰岛素水平降低、胰岛素抵抗指数升高及血脂水平的升高。

旷场实验是对实验动物在新环境中的自主行为、探究行为和紧张度进行评价的一种方法，能够反应大鼠焦虑抑郁的情绪倾向。实验结果显示，AD+T2DM组水平移动总距离、进入中央区次数、中央区滞留时间、中央区/周围区滞留时间均有减少，AD组直立次数和修饰次数都有减少，说明AD模型大鼠有抑郁倾向。焦虑和抑郁在AD中都很常见，有研究表明，有认知功能障碍的AD患者抑郁症状更严重，且与葡萄糖代谢的关系十分密切［18］，抑郁还可以介导糖尿病和认知能力受损［19］，但是本次实验中并未体现这样的结果。

Morris水迷宫实验表明T2DM组和AD+T2DM组大鼠均有学习记忆能力的缺失，说明T2DM也能在一定程度上引起学习记忆能力减退，这可能与血糖水平升高和胰岛素水平降低有关。糖代谢为生命活动提供能量和物质保障，血糖升高对神经元和胶质细胞的影响很大，如引起神经元内糖醇堆积，神经元得不到充足的血氧供应而营养不足；葡萄糖浓度过高与蛋白质、脂肪及核酸的氨基发生非酶催化反应形成晚期糖基化终末产物（advances glycation end products，AGEs），AGEs被认为是诱发AD和糖尿病的重要危险因素；高血糖会引起胰岛素抵抗，加速大脑衰老，破坏血脑屏障，改变其通透性，导致脑血管功能损伤，导致突触可塑性和认知功能的缺陷［20］。研究表明，在水迷宫实验中，高剂量胰岛素被用于改善空间学习和记忆能力，而低剂量的胰岛素会导致认知能力下降［21］。

脑内慢性神经炎症是AD等神经退行性疾病的重要标志，小胶质细胞作为脑内主要的免疫细胞，星形胶质细胞作为中枢神经系统的重要组成部分，与糖原、能量供应、炎症介质和神经营养因子的释放有关［22］，通过小胶质细胞和星形胶质细胞的活化产生炎症因子及能量营养供应减少使得神经元突触受损。研究表明，STZ诱导的糖尿病大鼠模型在早期就有星形胶质细胞数目增多、胞体变大和突起分支变长增多［23-24］；高糖促进产生AGEs，也可以和小胶质细胞表面的其细胞表面受体结合，NF-κB诱导活性氧并触发促炎因子释放，导致天然免疫的持续激活，从而分泌IL-1β、TNF-α和IL-6［25］。本研究通过免疫荧光染色和qPCR实验表明，T2DM可以在一定程度上促进AD大鼠的脑内炎症反应，小胶质细胞和星形胶质细胞活化增多，海马区炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加，加重脑内炎症反应，脑内稳态失衡。

神经元是大脑发挥正常功能的重要细胞单元，突触是神经元之间联系的部位，在学习记忆中发挥重要作用。PSD95是突触后致密区丰富的蛋白，可作为兴奋性突触的标记物，与突触后信号传递、损伤后的神经修复及树突棘形成有关［26-27］；synapsinI是表达在突触前膜囊泡的一种突触标志物，参与囊泡融合及递质的释放，与突触可塑性、信号传导关系密切［28］。为探究脑内炎症反应对于神经元的具体影响，本项工作从脑内神经元形态及突触蛋白PSD95，synapsinI表达入手，证明T2DM可以促进神经元发生形态改变，核深染、固缩，细胞内尼氏体减少，伴有突触蛋白的减少代表突触功能受损，神经元正常的生理功能受到损害，最终导致认知功能受损。

综上，本研究采用高脂食糜灌胃加STZ腹腔注射联合STZ侧脑室注射的方法，构建AD合并T2DM大鼠模型，同时也证明T2DM由于其糖脂代谢和胰岛素代谢的紊乱，可能会加重AD的脑内病变，从而在外部行为学上有所体现，为探究AD与T2DM发病之间的联系提供了动物模型的参考。然而，尽管动物模型已经尽可能参考前人经验，但是其成模标准的评价是否完善，是否与真实的人体疾病病理过程相符合仍然有待商榷，并且因为AD的病理机制复杂，很难构建出能够囊括AD全部特征的动物模型。制作更加实用有效、经济方便、且更符合人类疾病发展的动物模型，仍需进一步探索。