盐炙对补骨脂丸中2 种成分在脾肾阳虚泄泻大鼠体内药动学的影响

2022-12-03王金金李红伟张振凌李凯

中成药 2022年11期

周宁王金金李红伟张振凌李凯∗

（1.河南中医药大学，河南郑州450046； 2.河南省中药特色炮制技术工程研究中心，河南郑州450046）

补骨脂丸来源于宋代《魏氏家藏方》第六卷脾肾篇，由盐补骨脂、盐小茴香组成，用于治疗脾肾阳虚所致的遗精、遗尿、尿频，大便溏、食欲不振等症状［1⁃2］。课题组前期建立了脾肾阳虚泄泻大鼠模型，发现补骨脂丸温肾助阳、暖脾止泻作用优于补骨脂，而且盐炙后效果更强［3］，但在炮制过程中补骨脂丸主要成分补骨脂素、异补骨脂素煎出量呈降低趋势［4］，可能还与体内吸收有关，故需进一步研究上述2 种成分的体内吸收规律［5⁃6］。

在病理模型上开展药动学研究时，能更深入全面地阐明补骨脂、小茴香盐炙配伍对脾虚泄泻大鼠的增效机制，也更贴近临床实际［7⁃8］。因此，本实验建立脾肾阳虚泄泻大鼠模型，考察盐炙对补骨脂丸中补骨脂素、异补骨脂素体内吸收的影响，探讨增强止泻作用的关键环节，以期为阐释该制剂中药材炮制机理提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC⁃20ADXR 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；FA2104B 电子天平［上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司］；Sartorius BT25S 型电子分析天平［十万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；KQ⁃500DV 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZTW 型电子调温电热套（天津工业实验室仪器有限公司）；ZNHW 型智能恒温电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；TGL⁃16M 型高速冷冻离心机（常州金坛良友仪器有限公司）；多管涡旋振荡器；NV⁃15G 型氮吹仪（上海精密仪器仪表有限公司）；N⁃1100 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；0.5～10、5～50、20～200、100～1 000 μL 移液枪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］。

1.2 试剂与药物补骨脂（批号180301）、番泻叶（批号180901）购自亳州市张仲景中药饮片有限责任公司；小茴香（批号170101）购自亳州市永刚饮片厂有限公司，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为正品。氢化可的松注射液（批号21805101）购自遂成药业股份有限公司；氯霉素（批号Y15F10C80504）及补骨脂素（批号C12J8Q39802）、异补骨脂素（批号Y18O8H46134）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；水为屈臣氏蒸馏水。

1.3 动物 SPF 级SD 雄性大鼠，体质量210～250 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号SCXK（鲁）2019⁃0003，实验动物使用许可证号SYXK（豫）2015⁃0005，饲养于相对湿度45%～70%、温度22～26 ℃的清洁级动物房中。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBOX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～2 min，95%～80%B；2～5 min，80%～68%B；5～8 min，68%B；8～9 min，68%～55%B；9～14 min，55%B）；体积流量0.4 mL／min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量5 μL。

2.2 对照品、内标溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为1.029 0、1.005 0 mg／mL 的贮备液，分别精密量取适量，混合后甲醇制成质量浓度分别为82.320 0、48.240 0 μg／mL 的溶液，逐级稀释，即得（补骨脂素质量浓度分别为82.320 0、41.160 0、10.290 0、4.116 0、2.058 0、0.411 6、0.274 4 μg／mL，异补骨脂素质量浓度分别为48.240 0、24.120 0、6.030 0、2.412 0、1.206 0、0.241 2、0.160 8 μg／mL）。

2.2.2 内标溶液精密称取氯霉素适量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解稀释至刻度，即得（质量浓度为20.060 0 μg／mL），置于4 ℃冰箱中备用。

2.3 盐炙品制备

2.3.1 补骨脂参考文献［9］报道，取净补骨脂饮片适量，加20% 盐水（每100 g 补骨脂用10 mL盐水）拌匀，闷润4 h，置于炒制容器中，文火加热，炒制8.5 min，待表面黑色或黑褐色、微鼓起、气微香、味微咸时出锅，晾凉，即得。

2.3.2 小茴香参考文献［10］报道，取净小茴香饮片适量，加20% 盐水（每100 g 小茴香用10 mL盐水）拌匀，闷润，待盐水被吸尽后置于炒制容器中，文火加热，炒至微黄、微鼓起、色泽加深、偶有焦斑、味微咸时出锅，晾凉，即得。

2.4 水煎液制备

2.4.1 补骨脂丸取盐补骨脂12 g＋盐小茴香12 g（补骨脂丸）、盐补骨脂12 g＋生小茴香12 g（模拟补骨脂丸Ⅰ）、生补骨脂12 g＋盐小茴香12 g（模拟补骨脂丸Ⅱ）、生补骨脂12 g＋生小茴香12 g（模拟补骨脂丸Ⅲ），捣碎，过1 号筛，置于圆底烧瓶中，加8 倍量水浸泡30 min，回流提取30 min，滤过，再加6 倍量水回流提取30 min，滤过，合并2 次滤液，减压浓缩至生药量0.8 g／mL，即得（课题组前期测得补骨脂丸及模拟补骨脂丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中补骨脂素含量分别为0.134 7%、0.133 6%、0.221 8%、0.224 4%，异补骨脂素含量分别为0.104 4%、0.100 9%、0.172 5%、0.170 5%，氯化钠含量分别为0.032、0.016、0.016、0 g／mL）。

2.4.2 番泻叶取番泻叶适量，浸泡30 min 后加水煮沸10 min，2 层纱布滤过，滤液减压浓缩至生药量1.0 g／mL，即得，置于冰箱中保存。

2.5 分组、造模与给药大鼠适应性饲养3 d后，随机分为空白组、补骨脂丸组及模拟补骨脂丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组6只，除空白组以外其余各组大鼠先进行脾肾阳虚泄泻模型造模［11⁃13］，即每天上午灌胃给予氢化可的松注射液（15 mg／kg）以致肾阳虚，连续14 d，从第15 天开始每天灌胃给予冰番泻叶水煎液（10 g／kg）以致脾阳虚泻下，连续14 d。大鼠在给药前12 h 和给药后禁食，自由饮水，补骨脂丸组及模拟补骨脂丸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组按8 g／kg 剂量灌胃给予相应药物，空白组灌胃给予等量生理盐水。

2.6 血浆采集与处理大鼠给药后，于0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、7、9、12、24 h 眼眶静脉丛取血各约0.5 mL，置于1.5 mL 含肝素钠的试管中，4 ℃、12 000 r／min 离心10 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中冷冻保存。

检测前将血浆取出，冰水浴解冻，精密量取100 μL 至1.5 mL 离心管中，加入内标溶液10 μL、乙腈400 μL，涡旋3 min，12 000 r／min离心10 min，吸取上清液，氮气吹干，50 μL 甲醇复溶，超声处理2 min，涡旋3 min，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，置于100 μL 带有内插管的进样瓶中。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性试验取空白血浆、空白血浆＋内标＋对照品（补骨脂素、异补骨脂素质量浓度分别为4.116 0、2.412 0 μg／mL）、给药后24 h 血浆＋内标溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰峰形理想，内源性物质无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 线性关系考察精密量取空白血浆100 μL，加入对照品溶液50 μL、内标溶液10 μL，混匀，按“2.5”项下方法处理，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品、内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，1／X2作为加权系数，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7.3 精密度、准确度试验精密量取空白血浆100 μL，加入低、中、高质量浓度对照品溶液（分别含补骨脂素0.823 2、4.116 0、65.856 0 μg／mL，异补骨脂素0.482 4、2.412 0、38.592 0 μg／mL）各50 μL 及内标溶液10 μL，作为质控样品，平行5份，按“2.5”项下方法处理，在“2.1”项色谱条件下进样测定3 d，考察日内、日间精密度及准确度，结果见表2，可知均符合生物样品分析要求。

表2 各成分准确度、精密度试验结果（n＝5）Tab.2 Results of accuracy and precision tests for various constituents（n＝5）

2.7.4 提取回收率、基质效应试验取低、中、高质量浓度质控样品各5份，按“2.5”项下方法处理，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算2种成分、内标峰面积比值A；另取空白血浆100 μL，按“2.5”项下方法处理，上清液中加入上述质量浓度对照品溶液和内标溶液，氮气吹干，复溶，同法计算峰面积比值B；取上述质量浓度对照品、内标溶液适量，同法计算峰面积比值C，测定提取回收率、基质效应，公式分别为提取回收率＝（A／B）×100%、基质效应＝（B／C）×100%，结果见表3，可知血浆处理方法可行，无明显基质效应。

表3 各成分提取回收率、基质效应试验结果（n＝5）Tab.3 Results of extraction recovery and matrix effect tests for various constituents（n＝5）

2.7.5 稳定性试验取低、中、高质量浓度质控样品各5份，室温放置4 h，按“2.5”项下方法处理，考察室温稳定性；置于－20 ℃冰箱中冷冻保存12 h后，在室温下自动融化，反复操作3次，按“2.5”项下方法处理，考察冻融稳定性；在－20 ℃下放置30 d，按“2.5”项下方法处理，考察长期稳定性；按 “2.5”项下方法处理，在－4 ℃下放置12 h 后再进样分析，考察处理后稳定性，结果见表4，可知血浆在不同条件下稳定性良好，符合生物样品分析要求。2.8 体内药动学研究血药浓度⁃时间曲线见图2，再采用DAS 3.2.8 软件中的非房室模型计算Tmax、Cmax、AUC、T1／2、CLZ／F、MRT，SPSS 20.0 软件对其进行单因素方差分析，结果见表5～6。

表4 各成分稳定性试验结果（n＝5）Tab.4 Results of stability tests for various constituents（n＝5）

图2 各成分血药浓度⁃时间曲线Fig.2 Plasma concentration⁃time curves for various constituents

由表5 可知，与模拟补骨脂丸Ⅲ组比较，补骨脂丸组、模拟补骨脂丸Ⅰ组补骨脂素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），Tmax延长（P＜0.01），CLZ／F降低（P＜0.01），补骨脂丸组MRT0⁃∞延长（P＜0.01）；模拟补骨脂丸Ⅱ组补骨脂素CLZ／F降低（P＜0.05）。由表6 可知，与模拟补骨脂丸Ⅲ组比较，补骨脂丸组、模拟补骨脂丸Ⅰ组异补骨脂素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），Tmax延长（P＜0.05，P＜0.01），CLZ／F降低（P＜0.01），补骨脂丸组MRT0⁃∞延长（P＜0.01）；模拟补骨脂丸Ⅱ组异补骨脂素AUC0～t升高（P＜0.01）。

表5 补骨脂素主要药动学参数（，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for psoralen（，n＝6）

注：与模拟补骨脂丸Ⅲ组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

表6 异补骨脂素主要药动学参数（，n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for isopsoralen（，n＝6）

注：与模拟补骨脂丸Ⅲ组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3 讨论与结论

补骨脂素和异补骨脂素是同分异构体，两者在脾肾阳虚泄泻大鼠体内的药动学特征相似。本实验发现，与补骨脂生品配伍的模拟补骨脂丸Ⅱ、Ⅲ组比较，补骨脂盐炙品配伍的补骨脂丸组、模拟补骨脂丸Ⅰ组中补骨脂素、异补骨脂素Cmax、AUC0～t、AUC0～∞更高，表明盐炙能明显促进其吸收；与生补骨脂和生小茴香组成的模拟补骨脂丸Ⅲ组比较，由盐补骨脂和盐小茴香组成的补骨脂丸组中上述2种成分Tmax、T1／2、MRT0～∞延长，CLZ／F降低，表明盐炙能减慢其代谢和消除速度，从而延长药效持续时间，提高生物利用度，与文献［14］报道一致；与模拟补骨脂丸Ⅰ、Ⅲ组比较，补骨脂丸组、模拟补骨脂丸Ⅱ组两者吸收增加，代谢减慢，表明小茴香盐炙后也会对其体内吸收行为产生影响，即药物盐炙后配伍可改变其体内吸收。总之，补骨脂素、异补骨脂素作为补骨脂主要成分，盐炙后配伍可使两者代谢减慢，作用时间延长，吸收增强，可能是补骨脂丸中药材如此处理后能增强温肾暖脾止泻作用的原因，同时也提示成分煎出量高低与其体内吸收程度强弱未必呈正相关，可能是多种途径作为增效的关键环节来共同发挥药效作用。

另外，采用剂量修正更能反映盐在体内药动学层面对补骨脂素、异补骨脂素的影响。但盐在炮制、成分煎出过程中的影响（本实验所用盐炙品均为自行炮制）也是补骨脂丸和3 种模拟补骨脂丸之间上述2 种成分药动学差异的影响因素，故本实验在绘制血药浓度⁃时间曲线、计算药动学参数时未进行剂量修正，以期客观反映上述制剂药动学的差异。

综上所述，本实验采用HPLC 法测定补骨脂丸中主要成分补骨脂素、异补骨脂素在脾肾阳虚泄泻模型大鼠血浆中的血药浓度，分析由补骨脂和小茴香生品或盐炙品组成的补骨脂丸、3 种模拟补骨脂丸中上述2 种成分的体内药动学特征，并深入探讨盐炙后配伍对两者体内吸收的影响，可为揭示该制剂盐炙增效的关键环节提供有力的数据支撑。