一测多评法同时测定胆清胶囊中5 种成分

吴 春覃燕 杨慧丽 杨百科伍庆

（1.贵州中医药大学第二附属医院， 贵州 贵阳550001； 2.贵州圣济堂制药有限公司， 贵州 贵阳550001；3.贵州师范大学山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室， 贵州 贵阳550001）

胆清胶囊是由虎耳草、凤尾草、大黄等药材组成的苗药，具有清热利湿、舒肝利胆功效［1⁃2］，方中君药虎耳草主要成分岩白菜素、没食子酸具有保肝利胆功效［3⁃6］，大黄主要成分大黄酸、大黄酚、大黄素具有导泻清热、护肝作用［7⁃12］，与该制剂主治功能相吻合。目前，对胆清胶囊的研究主要集中在TLC 定性鉴别及其单一成分含量测定上，鲜有多种成分含量测定的报道［13⁃14］。

中药有效成分复杂多样，其相互作用会对疗效产生影响，具有多靶点、协同作用的特点，故仅对单一成分进行检测难以对其安全性、稳定性作全面控制［15⁃23］。一测多评法利用有效成分与内标之间的函数关系，只需测定1 种成分含量即可实现其他成分含量的测定，从而降低检测成本［15⁃23］，故本实验建立该方法同时测定胆清胶囊中大黄酸、岩白菜素、大黄酚、没食子酸、大黄素的含量，以期为该制剂安全性及质量控制研究提供技术支撑。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100、1260 高效液相色谱仪；AL⁃104 电子天平；HS6150 超声波清洗机。

1.2 试剂 大黄酚（批号110796⁃201520）、没食子酸（批号110831⁃201605）、大黄素（批号0756⁃9908，）、大黄酸（批号0757⁃9703）对照品均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；岩白菜素对照品（批号20170102，纯度98%）购自北京生物科学院与技术公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；水为自制超纯水。

1.3 药物 胆清胶囊（0.3 g／粒，批号20200202、20200203、20200204），由贵州圣济堂制药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱；流动相0.1%甲酸（A）⁃甲醇（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长275 nm；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取岩白菜素、大黄酸、没食子酸、大黄酚、大黄素对照品适量，甲醇制成贮备液，精密吸取适量，制成分别含岩白菜素0.031 mg／mL、大黄酸0.030 mg／mL、没食子酸0.019 mg／mL、大黄酚0.061 mg／mL、大黄素0.023 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取本品内容物1 g，精密加入25 mL 甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方工艺分别制备缺大黄、缺虎耳草、缺凤尾草、缺牛胆汁、缺大黄和虎耳草的阴性样品，按 “2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度均大于1.5，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various contituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下贮备液适量，甲醇依次稀释成5 个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得岩白菜素、大黄酸、没食子酸、大黄酚、大黄素峰面积RSD 分别为 1.57%、2.01%、1.96%、2.11%、1.89%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批本品，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得岩白菜素、大黄酸、没食子酸、大黄酚、大黄素含量RSD 分别为1.84%、1.68%、0.93%、1.54%、0.98%，表 明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、4、8、16、24、36 h 在“ 2.1”项色谱条件下进样测定，测得岩白菜素、大黄酸、没食子酸、大黄酚、大黄素峰面积RSD 分别为1.68%、1.26%、1.79%、0.91%、1.94%，表明溶液在36 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的同一批本品，平行6份，按100%水平加入对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，岩白菜素、大黄酸、没食子酸、大黄酚、大黄素平均加样回收率分别为98.92%、100.26%、99.62%、98.60%、99.79%，RSD 分别为1.07%、1.20%、1.26%、0.89%、1.05%。

2.3.7 相对校正因子计算 取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以大黄酸为内标，计算相对校正因子fk／s［21⁃22］，公式为fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表3。

表3 各成分相对校正因子（n＝6）Tab.3 Relative correction factors of various constituents（n＝6）

2.4 耐用性考察

2.4.1 仪器、色谱柱 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，考察Agilent 1260、Agilent 1100 色谱仪及Diamonsil C18、Agilent ZORBAX C18、Welchrom C18色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜1.58%）。

表4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2 色谱峰定位 采用相对保留时间法［21⁃23］。取“2.2.1”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜1.63%）。

表5 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.5 样品含量测定 取3 批样品，每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表6。由此可知，2 种方法所得结果接近［相对误差（RE）＜3%］，表明一测多评法可用于含量测定。

表6 各成分含量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件优化 预实验根据供试品、对照品溶液的保留时间⁃吸收强度⁃波长3D图，依据基线稳定性、非峰干扰、最大吸收，将紫外检测器波长设置为275 nm。再比较不同溶剂、溶剂比、梯度分布对流动相的影响，发现甲醇洗脱时峰分离效果较好，并且酸化后可减少尾峰，提高理论塔板数，最终确定为0.1%甲酸⁃甲醇。

3.2 内标选择 内标不仅要有明确的治疗效果和稳定的化学性质，而且需易获得，价格低廉。大黄酸是大黄主要有效成分之一，含量较高，保留时间适中，对照品廉价易得，并且色谱峰附近的干扰峰也较少，故选择其作为内标。

3.3 方法评价 本实验采用一测多评法时，先进行方法学考察，再对相对校正因子、相对保留时间进行验证，发现该方法具有较好的重复性，两者RSD 均小于2%。含量测定结果表明，一测多评法与外标法的RE 小于3%，表明该方法准确可靠，可用于含量测定。

4 结论

本实验建立一测多评法同时测定胆清胶囊中大黄酸、岩白菜素、大黄酚、没食子酸、大黄素的含量，发现该方法具有良好的准确性、稳定性、重复性，在缺乏相应对照品的情况下是可行的，可为该制剂质量控制研究提供依据，也能为其他中药复方制剂的相关考察提供全面可靠的评价策略。