HPLC⁃MS／MS 法同时测定朱日亨滴丸醇提液中7 种成分

2022-12-03李君董馨陆景坤祖文白图雅胡玉霞张梦迪

中成药 2022年11期

李君董馨∗陆景坤祖文白图雅胡玉霞张梦迪

（1.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，内蒙古呼和浩特010110； 2.内蒙古医科大学新药筛选工程研究中心，内蒙古呼和浩特010110； 3.内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特010110； 4.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古呼和浩特010110）

朱日亨滴丸系蒙医国医大师苏荣扎布的临床验方，由广枣、红花、栀子、沉香、肉豆蔻等9 味药材组成，方中广枣性味甘、酸而平，效重、腻，能镇“赫依”，作为君药；肉豆蔻性味辛而温，主镇司命“赫依”，为臣药；辅以止痛、清血热的沉香、栀子等药材，全方共奏清心火、活血化瘀、改善心功能之功效［1⁃3］，用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常等［3⁃6］。课题组前期对朱日亨滴丸剂型进行了深入研究［7］，但在醇提取工艺考察过程中仅选择没食子酸、羟基红花黄色素A 作为质量控制指标［8］，成分数量偏少，不能全面评价制剂质量，并且采用HPLC 进行含量测定，耗时较长，灵敏度较低。因此，本实验采用高效液相色谱⁃质谱串联（HPLC⁃MS／MS）法同时测定朱日亨滴丸醇提液中没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山柰酚、栀子苷的含量，可为该方多组分的定量分析提供依据，也为其医院制剂申报提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器 LC⁃MS8045 型三重四极杆UPLC⁃ESI⁃MS 联用系统（配置LC⁃20AD 型输液泵、DGU⁃20A5R 型在线脱气机、SIL⁃20AC 型自动进样器、CTO⁃20A 型柱温箱、CBM⁃20A 型系统控制器、FCV⁃20AH2 型阀切换系统）、AP135W 型电子天平（十万分之一）（日本Shimadzu 公司）；KH⁃500DV型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；DZTW 型电子调温电热套（上海力辰邦西仪器科技有限公司）。

1.2 试剂与药物广枣（批号C20022403）、栀子（批号1909010354）、红花（批号19091202）均购自内蒙古北域药业有限责任公司，经内蒙古医科大学药学院中药资源教研室渠弼教授鉴定，广枣为漆树科植物南酸枣Choerospondias axillaris（Boxb.）Burtt et Hill.的干燥成熟果实，栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果实，红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。朱日亨滴丸原处方中广枣、栀子、红花比例为10∶3∶4（其他药材比例不纳入研究），其传统剂型为散剂，混合粉碎后过筛、分装，即可服用。鞣花酸（批号111959⁃201903，纯度≥88.8%）、山柰酚（批号111861⁃202013，纯度≥93.2%）、西红花苷（批号111588⁃201704，纯度≥88.4%）、羟基红花黄色素A（批号111637⁃201810，纯度≥93.1%）、槲皮素（批号100081⁃201810，纯度≥99.1%）、没食子酸（批号110831⁃201906，纯度≥91.5%）、栀子苷（批号110749⁃201919，纯度≥97.1%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈均为色谱纯；甲酸、乙酸铵均为分析纯；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液按处方比例称取朱日亨滴丸各味药材共约68 g，置于圆底烧瓶中，加入40%乙醇408 mL，于磁力加热搅拌电热套上加热提取60 min，冷却至室温，滤液用40% 乙醇定容至500 mL量瓶中，取10 μL，加入990 μL 70%甲醇，涡旋混匀30 s，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2 对照品溶液精密称取没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山柰酚、栀子苷对照品适量，甲醇制成各成分质量浓度分别为436.00、483.00、566.00、547.00、511.00、486.00、458.00 μg／mL 的贮备液，依次精密吸取50.00、300.00、10.00、20.00、100.00、10.00、400.00 μL，甲醇定容至5 mL，即得。再分别吸取5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00、200.00、300.00、400.00 μL，70% 甲醇定容至1 mL，得到系列质量浓度，见表1。

表1 对照品溶液质量浓度Tab.1 Concentrations of reference solutions

2.2 分析条件 Shim⁃pack GIST⁃HP C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～0.5 min，10% A；0.5～3.0 min，10%～45%A；3.0～5.0 min，45%～75%A；5.0～5.5 min，75%～95%A；5.5～7.0 min，95% A；7～7.01 min，95%～10.0% A；7.01～9 min，10.0%A）；体积流量0.25 mL／min；柱温35 ℃；进样量3 μL。电喷雾（ESI）离子源，负离子模式检测；多重反应监测（MRM）模式；雾化气体积流量3 L／min；加热气体积流量10 L／min；接口温度300 ℃；脱溶剂温度526 ℃；加热块温度400 ℃。其他质谱参数见表2，多重反应监测色谱图见图1，对照品二级质谱图见图2。

表2 各成分质谱参数Tab.2 MS parameters for various constituents

图1 各成分多重反应监测色谱图Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of various constituents

图2 各对照品二级质谱图Fig.2 MS／MS spectra for various reference substances

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液，在“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，并以信噪比S／N≥10 为定量限，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验取表1 中编号2、4、6 的对照品溶液，在“2.2”项条件下进样测定6次，测得没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山柰酚、栀子苷峰面积RSD 分别为 0.66%～2.92%、1.04%～2.21%、0.74%～1.99%、2.17%～2.43%、0.98%～2.51%、0.95%～2.76%、1.00%～2.75%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验取同一份供试品溶液，于0、3、6、12、24 h 在“2.2”项条件下进样测定，测得没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山柰酚、栀子苷峰面积RSD 分别为2.65%、1.89%、2.45%、2.66%、2.75%、1.82%、1.83%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验取同一批滴丸，按“2.1.1”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，测得没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山柰酚、栀子苷峰面积RSD 分别为4.84%、4.03%、2.37%、3.90%、3.61%、3.03%、4.04%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验取各成分含量已知的同一批滴丸药材粉末6份，加入1∶1 含量比例的对照品溶液（没食子酸6.84 mg／mL、羟基红花黄色素A 60.38 mg／mL、槲皮素0.28 mg／mL、鞣花酸5.47 mg／mL、西红花苷Ⅰ25.55 mg／mL、山柰酚0.24 mg／mL、栀子苷114.50 mg／mL）各1 mL，在“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、羟基红花黄色素A、槲皮素、鞣花酸、西红花苷Ⅰ、山柰酚、栀子苷平均加样回收率（RSD）分别为96.66%（3.60%）、95.85%（4.03%）、102.98%（2.61%）、101.31%（5.90%）、100.35%（5.69%）、97.50%（4.87%）、104.20%（2.55%）。

2.4 样品含量测定取6 批滴丸药材，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果Tab.4 Results of content dtermination of various constituents

3 讨论

本实验对不同流动相（甲醇⁃0.1% 甲酸、乙腈⁃0.1%甲酸、乙腈⁃10 mmol／L 乙酸铵）、稀释液（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）进行考察，发现70%甲醇稀释后乙腈⁃0.1%甲酸洗脱时各成分峰型及响应最优。课题组前期确认，本实验所测定的7 种成分在负离子模式下响应值优于正离子模式下，其中栀子苷得到1 个羧基而形成m／z433.1［M＋HCOO］－准分子离子峰，并且存在m／z411.1［M＋Na］＋准分子离子峰［9］，而［M＋HCOO］－响应值明显优于［M＋Na］＋，故确定其母离子为m／z433.1。在负离子模式下，以不同碰撞能量对母离子进行产物离子扫描，取2 对碎片离子作为定性离子对，响应强度最高者作为定量离子对，在此基础上通过电压优化来确定最终碰撞能量和离子对。

现代研究表明，栀子含有多种成分，其中环烯醚萜苷、色素为主要活性物质，具有抗动脉粥样硬化、增强心血管保护作用［10］；广枣中的酚酸类成分没食子酸、鞣花酸及黄酮醇类成分槲皮素具有显著的抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌作用［11⁃12］；红花中的查尔酮类化合物羟基红花黄色素A 及黄酮醇类成分山柰酚具有改善心肌缺血、减少脑部栓塞的功效［13］。根据2020 年版《中国药典》及文献［14⁃16］报道，本实验所测定的7 种成分在乙醇中均有较好的溶解性，故以其为溶剂进行提取。