microRNA-22对调控软骨细胞自噬的影响及其在骨关节炎发病中的作用机制

颜世举，董文静，李志锐，赵燕鹏，韩 涛，魏均强，王俊良，林 峰

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种最常见的关节退行性疾病[1]，其病情进展与年龄呈正相关。中老年人发病率较高[2]，对生活质量产生严重影响，且是致畸致残的重要因素[3]。细胞自噬(autophagy)是真核细胞中广泛存在的分解再利用系统，具有高度保守性[4]。自噬通过清除、降解受损细胞器或功能失调的大分子，以维持细胞内环境稳态，高效利用营养物质，促进细胞生存[5]。研究表明，自噬对于维持软骨组织新陈代谢的平衡具有重要作用，软骨细胞自噬水平降低是OA的重要病理变化标志之一，并参与了OA的发生与发展[6]。

microRNA即微小RNA，是一类高度保守的非编码单链RNA，广泛存在于真核生物细胞内[7]。microRNA不参加基因的转录和翻译过程，可与下游目标靶基因mRNA 中3′端非编码区(3′-UTR)特异性结合，分解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA蛋白翻译过程，起到基因沉默的作用[8]。目前关于OA相关特异性microRNA及其靶基因调控网络已有报道[9, 10]，同时研究表明，microRNA-22在OA软骨组织、关节液中异常高表达[11, 12]，但其具体作用机制尚不十分清楚。因此本研究聚焦microRNA-22对软骨细胞自噬的影响，进而探讨其在OA发病中的作用，为临床诊断及治疗提供新的思路。

1材料与方法

1.1 实验细胞 OA软骨组织取自解放军总医院海南医院骨科因重度OA行人工膝关节置换术患者术中膝关节软骨，共14例。健康软骨组织取自外伤行截肢术患者术中膝关节软骨，共12例。每例软骨标本均获得患者完全知情同意。

1.2 试剂及仪器 Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Millipore，美国)，Taqman微小RNA逆转录试剂盒、Taqman MicroRNA assays(Applied Biosystems，美国)，Lipofectamine 2000 (Life technologies, 美国)，miR-22模拟物、抑制物(广州锐博)，LC3B抗体、Collagen Ⅱ(COL2A1)抗体、GAPDH抗体(Cell Signaling Tech，美国)，结晶紫(南京凯基)。

1.3 人软骨细胞获取与培养 无菌条件下获取人软骨组织，去除滑膜、结缔组织等杂质，在超净台中切碎至1 mm3大小颗粒，PBS冲洗后0.25%胰蛋白酶于37 ℃培养箱消化30 min，PBS冲洗后加入0.2%Ⅱ型胶原酶于37 ℃恒温摇床中缓慢摇动孵育12 h，滤网过滤后，PBS冲洗，1000 r/min，离心5 min，弃去上清，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养液混匀，将软骨细胞以2×105/ml接种于培养瓶中，置于5%CO2饱和湿度、37 ℃恒温细胞培养箱内培养。每48 h更换培养液1次，同时观察原代软骨细胞生长状态。待软骨细胞生长至融合度80%时按1∶3传代培养。

1.4 荧光定量PCR microRNA-22在健康、OA软骨细胞中的表达水平 待健康软骨细胞、OA软骨细胞处于对数生长期，使用Trizol裂解液从软骨细胞中提取总mRNA。取1 μg总RNA，使用Taqman微小RNA反转录试剂盒进行反转录，Taqman MicroRNA assays试剂盒进行荧光定量PCR反应。扩增程序设置：(1)Tap酶激活：95 ℃，10 min；(2)扩增反应：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。以小核RNA U6为管家基因，采用2-△△Ct法计算microRNA-22在正常软骨细胞、OA软骨细胞中的相对表达水平。

1.5 Western blot检测健康、OA软骨细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ的表达及其比值LC3B-Ⅱ/Ⅰ 待健康软骨细胞、OA软骨细胞处于对数生长期、生长状态良好时，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解软骨细胞，获取总蛋白；配制SDS-PAGE蛋白凝胶，取等量蛋白，上样，设置恒压80 V电泳蛋白样品；设置恒压100 V、90 min转膜，使用含有5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭90 min，并与LC3B一抗、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗，与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下孵育1 h，TBST清洗，加入显色底物;采用Image J图像分析软件，获取、分析各组条带灰度值，进行统计学处理。

1.6 平板克隆形成实验microRNA-22对软骨细胞活性的影响 将软骨细胞分为空白组、miR-22模拟物组、miR-22抑制物组，待细胞进入对数生长期时，进行Lipofectamine 2000细胞转染，三组软骨细胞分别转染miR-22阴性对照、模拟物、抑制物序列，转染序列终浓度为100 nM。转染12 h后弃去转染体系，更换为10% FBS完全培养液，继续恒温细胞孵箱内培养48 h后，胰蛋白消化、收集细胞，将三组细胞接种在6孔板中，300个/孔，使用10% FBS完全培养液继续培养。14 d后，室温下甲醇固定20 min，PBS清洗后以结晶紫染液室温下染色20 min，显微镜下拍照，并计数细胞克隆数。实验重复4次。

1.7 Western blot检测microRNA-22对软骨细胞自噬的影响 将软骨细胞分为空白组、miR-22模拟物组、miR-22抑制物组，采用上述转染方法转染三组软骨细胞，转染12 h后弃去转染体系，更换为10% FBS完全培养液，继续恒温细胞孵箱内培养48 h后，胰蛋白消化、收集细胞，将三组细胞接种在6孔板中，1×105个/孔，待软骨细胞进入对数生长期时，弃去培养液，PBS缓冲液轻轻清洗2次，提取细胞总蛋白，Western blot检测软骨细胞LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Collagen Ⅱ的表达水平，方法同前所述。

2结 果

2.1 microRNA-22在健康、OA软骨细胞中的表达水平 荧光定量PCR检测结果显示，OA软骨细胞中microRNA-22表达含量(2.50±0.39)显著增高，约为健康软骨细胞(0.98±0.25)的2.5倍，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 健康、OA软骨细胞中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ的表达 Western blot检测结果显示，与健康软骨细胞相比，OA软骨细胞自噬相关蛋白LC3B的Ⅱ类亚型含量显著降低(图1)；OA软骨细胞(4例)LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值为1.25±0.13，健康软骨细胞(4例)LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值为1.85±0.21，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 骨关节炎自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Ⅰ在健康、

2.3 microRNA-22对软骨细胞克隆形成能力的影响 平板克隆形成实验检测结果显示：与空白对照组(107.33±14.3)相比，软骨细胞转染miR-22模拟物后，细胞克隆形成数量(75.67±11.36)显著降低(P<0.01)；与空白对照组相比，软骨细胞转染miR-22抑制物后，细胞克隆形成数量(128.5±9.95)显著增高(P<0.05，图2)。

图2 骨关节炎microRNA-22对软骨细胞克隆形成能力的影响

2.4 microRNA-22对软骨细胞自噬及OA发生发展的影响 Western blot检测结果显示：与空白对照组细胞相比，miR-22模拟物组软骨细胞中LC3B-Ⅱ含量显著降低，LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值降低，Ⅱ型胶原Collagen Ⅱ的表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-22抑制物组软骨细胞中LC3B-Ⅱ含量显著增高，LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ比值增高，同时Ⅱ型胶原Collagen Ⅱ的表达水平增高，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 骨关节炎microRNA-22对软骨细胞自噬的影响

表1 骨关节炎microRNA-22对软骨细胞自噬的影响

注：与空白对照组相比，①P<0.05

组别LC3B-ⅠLC3B-ⅡLC3B-Ⅱ/ LC3B-ⅠCollagen Ⅱ空白对照组1.01±0.031.92±0.111.90±0.140.98±0.09miR-22模拟物组1.03±0.081.50±0.20①1.45±0.13①0.51±0.09①miR-22抑制物组1.02±0.072.36±0.19①2.30±0.08①1.31±0.03①

3讨 论

OA是最常见的关节退行性疾病，病变主要累及膝关节、踝关节、髋关节等负重关节，亦常见于指间关节、腕关节等活动关节[13]。OA临床主要表现为受累关节进行性疼痛、肿胀，关节间隙变窄，骨赘生物形成，活动受限等[14]。目前认为，关节软骨退变、分解是骨关节主要的病理改变之一[15]。软骨细胞是软骨组织中唯一存在的细胞类型，对于维持生理条件下软骨组织合成与分解代谢的稳态具有重要意义[16]。在OA发病过程中，各种致病因素共同作用下，软骨细胞合成的Ⅱ型胶原等功能蛋白减少并且结构异常，功能受损，正常细胞表型逐渐丢失，无法维持软骨基质稳态，促进了OA的发生与发展[17]。因此，本研究聚焦关节软骨细胞，通过胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶序贯消化软骨基质，获得健康、OA原代软骨细胞，应用于后续研究可最大限度模拟人体内环境。

microRNA是一类非编码单链RNA，广泛存在于动植物体内，在进化中高度保守。近年来研究表明，microRNA广泛参与了骨关节发病与进展，受到广泛关注。在大鼠膝关节OA模型中，上调miR-29a可通过TLR4/Myd88/NF-κB信号通路失活化抑制大鼠滑膜细胞炎症反应，保护滑膜损伤，延缓OA进展[18]。Yan等[10]报道，microRNA-34a通过抑制SIRT1/P53通路，促进软骨细胞凋亡，参与了OA发病。文献[11, 12]报道，microRNA-22在OA软骨组织、关节液中异常高表达，提示microRNA-22可能参与了OA发生与发展。同时，研究表明microRNA-22在多种疾病中可调控细胞自噬[19, 20]，由此我们设计了本研究方案，探索microRNA-22对软骨细胞自噬的影响，进而初步阐释microRNA-22在OA发病机制中的重要作用。

通过检测microRNA-22在健康、软骨细胞中的表达水平，发现microRNA-22在OA软骨细胞中异常高表达，同时检测健康、OA软骨细胞中自噬水平，发现OA软骨细胞中自噬水平受到抑制。因此我们认为，microRNA-22可能通过调控软骨细胞自噬，促进OA的发生与发展。

细胞自噬是一种自我降解的过程，真核细胞通过降解异常状态的细胞器、大分子，以维持细胞正常的新陈代谢[21]。研究表明，生理水平的细胞自噬对于软骨细胞维持软骨组织正常生理功能具有十分重要的意义，同时在体内软骨细胞自噬水平随着年龄增加而衰减[22]。本实验中通过转染microRNA-22模拟物、抑制物，上调、下调软骨细胞中microRNA-22的表达水平，发现转染microRNA-22模拟物可抑制软骨细胞自噬，同时抑制软骨细胞特征性蛋白—Ⅱ型胶原的表达；与之相反，转染microRNA-22抑制物可促进软骨细胞自噬，同时促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，提示microRNA-22通过抑制软骨细胞自噬，参与了OA的发病与进展。

文献[23]研究表明，软骨组织损伤时，软骨细胞会进入增殖状态，以应对外界环境的不利因素，维持软骨组织代谢平衡，从而发挥软骨的生理功能。平板克隆形成实验中，我们发现转染microRNA-22模拟物可抑制软骨细胞克隆形成能力，转染microRNA-22抑制物可促进软骨细胞克隆形成，提示microRNA-22可抑制软骨细胞增殖能力，在OA发病中起到重要作用。

综上所述，本研究发现microRNA-22在OA软骨中异常高表达，OA软骨细胞中自噬水平受到抑制，与此同时，上调软骨细胞中microRNA-22水平可抑制软骨细胞自噬，抑制软骨细胞增殖能力，抑制软骨细胞Ⅱ型胶原合成，促进OA发病。由此可见，microRNA-22可作为OA潜在的临床诊断的特征性分子和治疗靶点，受到进一步关注。本实验仅在体外细胞学水平进行了探索，仍需进一步在动物实验中进行验证。