血液lncRNA 00707检测在胃癌辅助诊断中的临床价值

史恒川 孔姗

胃癌(gastric cancer，GC)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其发病率在所有肿瘤中占第6位，而死亡率位居第3位[1]。研究显示，50%的胃肠道癌病例发生在中国，其中胃癌所占比例最大，五年总生存率小于35%[2]。幽门螺杆菌感染、饮食、饮酒、吸烟等都是致病的因素[3]。在胃癌的治疗中主要依靠外科技术、传统的放化疗和新辅助治疗[4]。然而，由于胃癌很少被早期诊断，大多数病人通常已经进展到晚期才发现。内镜检查和病理检查是胃癌早期筛查的金标准，但具有创伤性的缺点；血液癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)水平检测被认为是一种无创的方法，但诊断效率低[5]。这意味着迫切需要寻找一种特异性和敏感性较高的筛选指标。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度>200 bp且不具备编码蛋白能力的RNA[6-7]，它可在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达[8]。近年来研究表明，lncRNA可作为一种生物标志物参与调控肿瘤转移进程，对肿瘤的早期筛查和诊断具有特殊的临床意义，但由于肿瘤发生转移的机制复杂，其具体分子机制尚不清楚[9-10]。

本研究首先通过胃癌高通量测序筛选出在胃癌组织中高表达2倍以上差异的lncRNA，经过TCGA数据库以及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的初步验证，筛选出lncRNA 00707。然后通过比较胃癌病人和健康对照组血清中的表达水平差异，监测肿瘤动态，探讨血清lncRNA 00707是否可作为肿瘤标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年12月至2021年12月经病理诊断初诊为胃癌的病人40例，其中男23例，女17例，年龄60～89岁，同时选取经胃镜检查排除胃部疾病的健康体检者40例，其中男29例，女11例，年龄60～83岁。

1.2 研究方法

1.2.1 血清标本收集：采集入组胃癌病人手术前后的血清标本以及健康体检者的血清标本，用含有分离胶的真空采血管采集血液标本，4000 r/min离心6 min，吸取上层血清1mL于无酶EP管中，保存用于检测lncRNA 00707。同时用雅培I2000SR全自动免疫发光分析仪检测胃癌病人及健康体检者肿瘤指标CEA、CA19-9，用雅培C16000全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、UA、肌酐(Cr)。

1.2.2 RNA提取：提取胃癌病人和健康体检者以及各细胞系中的总RNA，采用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)值为1.8～2.0的样本用于后续实验。

1.2.3 RT-qPCR ：按照试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，将获得的cDNA进行qPCR扩增反应。采用Roche 480 PCR仪检测，循环参数：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。采用 2-ΔΔCt法分析相对表达量。

1.2.4 细胞培养：胃癌细胞株(BGC-803、MKN-45)培养于含10%FBS和1%三抗溶液的RPMI-1640完全培养基中，胃正常上皮细胞(GES-1)培养于含10% FBS和1%三抗的DMEM 培养基中，在37 ℃、5% CO2的湿润培养箱中生长。

2 结果

2.1 血清lncRNA 00707检测方法的创新 选择常用的内参18S，采用RT-qPCR方法检测lncRNA 00707和18S的熔解曲线，可见熔解曲线单峰特异。随机混合30例健康体检者血清，分成10份，同一批次检测10个复孔，检测 lncRNA 00707的表达量，计算批内CV；每天提取并检测一份混合血清中lncRNA 00707的表达量，计算批间CV。结果显示，RT-qPCR检测血清中lncRNA 00707有良好的重复性。将混合血清室温放置 1、2、3、4、5 h，采用RT-qPCR检测lncRNA 00707的表达。结果显示，lncRNA 00707的表达变化没有统计学差异；另一方面，将混合血清在-80 ℃条件下反复冻融 0、1、3、5、10次，采用RT-qPCR检测lncRNA 00707的表达，结果同样显示，lncRNA 00707的表达变化没有统计学差异(见图1)。

图1 RT-qPCR检测LNCRNA 00707的方法评价

2.2 血清lncRNA 00707在胃癌中的表达水平 与健康体检者比较，胃癌病人血清中lncRNA 00707的表达水平显著升高(2.644±0.334比1.271±0.123，P=0.0002)，血清CEA、CA19-9水平也显著升高(P<0.01)。见表1。

表1 2组生化、肿瘤指标水平比较

2.3 血清lncRNA 00707的诊断价值 ROC曲线显示，lncRNA 00707、CEA、CA19-9分别作为诊断指标时，AUC为0.751(95%CI：0.646～0.855)、0.658(95%CI：0.537～0.779)和0.693(95%CI：0.573～0.814)；lncRNA 00707具有最大的诊断效能。将lncRNA00707与CEA联合分析，ROC曲线下面积为0.765(95%CI：0.663～0.867)，联合诊断时获得更大的诊断效能。

2.4 血清lncRNA 00707作为诊断标志物的循环潜力 我们在胃癌细胞(BGC-803和MKN-45)培养液和正常胃上皮细胞(GES-1)培养液中检测lncRNA 00707的表达水平，结果显示，lncRNA 00707的表达水平在一定时间内随着胃癌培养时间的增加而增加，而在正常胃上皮细胞培养基中表达水平没有统计学差异。结果表明，血清中lncRNA 00707可能由肿瘤细胞释放入血液(见图2A)。

动态监测20例胃癌初诊病人血清lncRNA 00707的表达量，结果发现，与术前相比(3.756±0.5473)，胃癌病人术后血清lncRNA 00707表达水平总体下降1.883±0.2907，且差异有统计学意义(见图2B)。

图2 血清lncRNA 00707的来源和循环监测潜力

3 讨论

众所周知，胃癌是最常见的消化道肿瘤之一。胃癌起病隐匿，如果早发现大多可以治愈，寻找胃癌的早期诊断和精准治疗的生物标志物具有重要意义。全基因组和转录组测序为lncRNA的研究打开了新的序幕，而lncRNA曾被认为是转录的“噪声”[11]。lncRNA的异常表达可以引起人类的各种疾病和紊乱[7]，监测这些差异表达的lncRNA有利于感知人体的异常状态，从而达到早期诊断的目的。

近年来，一系列研究证明，lncRNA可以作为诊断癌症的标志物，其中也包括胃癌。Wang等[12]的研究显示，胸腔积液lncRNA可有效区分肺癌相关的恶性胸腔积液与良性胸腔积液。Tantai等[13]证实，血清 XIST和HIF1A-AS1在非小细胞肺癌中表达增加，XIST和HIF1A-AS1联合诊断获得更高的阳性诊断率，AUC为 0.931。Li[14]报道了linc00152对非小细胞肺癌的诊断准确率较高，linc00152与CEA联合使用比单独使用linc00152、CEA的诊断效率更高。所有这些证据表明lncRNA在血液中可稳定存在，并且可以被检测，可作为癌症诊断和预后监测的潜在生物标志物。本实验采用RT-qPCR检测lncRNA 00707在胃癌病人中的表达，具有良好的重复性和稳定性。结果显示胃癌病人血清中lncRNA 00707的表达明显高于健康体检者。初步构建一种新的诊断模型，将lncRNA 00707与传统肿瘤标志物CEA联合检测，显著提高了胃癌病人的诊断效率。此外，手术后病人血清lncRNA 00707显著下降，达到与健康体检者相似的水平，这在一定程度上预示着疾病的改善或没有进展。

总之，升高的血清lncRNA 00707可能是一种潜在的胃癌诊断生物标志物，并可用于监测肿瘤动态。后期我们将继续扩大样本量，同时追踪随访，动态监测lncRNA 00707的表达在放化疗治疗前后的变化，分析病人的生存时间与lncRNA 00707表达水平之间的相关性，进一步验证血清lncRNA 00707检测的临床应用价值。