应用血肌酸激酶或肌酸激酶MM同工酶筛查新生儿杜氏肌营养不良症的系统评价/Meta分析

唐 亮 陈晓晴 谭伟强 程浣彤 綦向军

杜氏肌营养不良(DMD)是一种X连锁隐性遗传的进行性、致死性神经肌肉疾病，发病率为1/(3 500～5 000)活产男婴[1]。该病由编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因突变所致，女性多为携带者，男性患儿通常在2～3岁隐匿起病， 15岁左右丧失行走能力，30岁前因呼吸或心力衰竭而死亡[2]。

由于DMD起病隐匿，其临床诊断通常延迟。既往由于对DMD缺乏有效的治疗方法，使得新生儿DMD筛查的意义难以体现。近年来，分子生物学技术的发展使基因治疗成为DMD最有希望的疗法，目前已有多种基因治疗药物获批临床应用或进入临床试验[3-5]。在新生儿期进行DMD筛查，有利于早期诊断及个体化精准治疗，延缓疾病进展，改善预后。同时，随着我国生育政策的调整，早期筛查有利于遗传咨询和优生优育，减少DMD患儿的出生。DMD患儿血液中CK显著升高是早期重要的生化改变[6]。1975年至2011年，全球10个DMD筛查项目共筛查了180多万名新生儿，以滤纸干血片样本CK值为筛查指标，以基因检测或肌肉活检为诊断金标准，确诊344例DMD患儿，患病率约为1/5 000[7,8]。近年研究发现CK-MM 在新生儿DMD筛查中具有更高的特异度[6]。2019年12月美国FDA批准了 Perkin Elmer公司的GSP血清CK-MM 试剂盒用于新生儿DMD筛查，目前国内外已逐渐开展相关的研究工作[6,9-11]。

目前仅见1篇采用CK筛查新生儿DMD的系统评价/Meta分析[12]，尚无采用CK-MM筛查新生儿DMD的系统评价。本文检索国内外数据库，系统评价以CK或CK-MM筛查新生儿DMD的准确性，为完善筛查方法、提高筛查准确性提供证据。

1 方法

1.1 PIROS的构建 P：新生儿，I：血CK或CK-MM，R：基因检测或肌肉病理，O：诊断参数，S：诊断准确性研究。

1.2 检索策略

1.2.1 检索数据库 Medline(PubMed)、Embase、Cochrane Library、Web of Science、Scopus、中国知网数据库、中国生物医学文献数据库、万方数据库和维普中文期刊全文数据库。

1.2.2 检索起止时间 检索起始时间均为1975年1月1日，Medline(PubMed)检索截止时间为2022 年 11 月5日，其他中英文数据库检索截止时间为2022年10月5日。

1.2.3 中英文不同数据库检索式及截屏 见本文附件1(http://www.cjebp.net/CN/10.3969/j.issn.1673-5501.2022.05.004)。

1.3 文献筛选 NoteExpress软件去除不同数据库重复文献。①初筛：由唐亮、谭伟强分别阅读文题和摘要筛选，排除无摘要的论文、学位论文、会议摘要、传统综述(不包括系统评价/Meta分析)、病例报告、流行病学调查以及与选题明显不相关的文献。②复筛：由唐亮、谭伟强对经过初筛后可能符合纳入标准的、已公开发表的文献阅读全文筛选，排除无法获取全文、全文非中文和英文、与主题不相关的文献和不能提取诊断准确性研究四格表数据的文献，重复发表的文献选择数据最全、最近更新的文献。③人工筛选：追溯相关系统评价/Meta分析及纳入研究的参考文献。

1.4 资料提取 由唐亮、谭伟强提取文献数据，提取内容包括文题、发表年份、研究起止时间、国家、筛查方法(CK或CK-MM)及其截断值、筛查人群、筛查年龄、样本量、诊断金标准、真阳性(TP)例数、假阳性(FP)例数、真阴性(TN)例数、假阴性(FN)例数。

1.5 文献偏倚风险和临床适用性评价 采用 QUADAS-2评价工具[13]，从4个领域的11个条目对纳入文献按“是”、“否”和“不确定”进行评价。4个领域中≥3个低风险(LR)和高风险(HR)分别为高质量和低质量，2个LR+1个HR即为低质量，2个LR+2个不确定(UR)即为中等质量，1个LR+3个UR或 4个UR即为低质量。

1.6 统计学分析 应用Stata 15.0和Meta-Disc 1.4软件进行统计分析。异质性检验采用I2检验，I2>50%认为异质性较大，行阈值效应及非阈值效应检测，若为阈值效应引起异质性，则绘制综合受试者工作特征曲线(SROC)并计算AUC；若为非阈值效应引起异质性，则通过Meta回归分析及亚组分析探寻潜在的异质性来源，并采用随机效应模型合并敏感度、特异度、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)、诊断比值比(DOR)、AUC和Q指数值。≥10篇文献则通过Deeks漏斗图进行发表偏倚检验，当P<0.05 时，认为存在显著的发表偏倚。

2 结果

2.1 文献筛选流程及结果 图1显示，共检索到229篇相关文献，人工筛选到2篇文献，共计231篇。剔除重复文献115篇，并经过阅读文题和摘要排除89篇，27篇进入全文阅读，其中11篇被排除，最终纳入16篇文献。其中CK-MM筛查文献5篇[14-18]，CK筛查文献11篇[19-29]。

图1 文献筛查流程及结果

2.2 纳入文献一般特征

2.2.1 CK-MM 表1显示，5篇文献[14-18]发表于2020至2022年，中文和英文分别为2篇[17,18]和3篇[14-16]；中国4篇(大陆3篇[14,17,18]，台湾1篇[15])，美国1篇[16]。3篇[14-16]筛查人群为新生儿，2篇[17,18]为新生男婴；共筛查156 547例；CK-MM初筛截断值均≥500 ng·mL-1，1篇[16]设置了不同年龄区间动态值，1篇[15]考虑了胎龄因素；诊断金标准均为基因检测，真阳性15例，假阳性45例，假阴性0例，真阴性156 487例。

表1 DMD筛查纳入文献一般特征

2.2.2 CK 表1显示，11篇[19-29]文献发表于1979至2015年，中文和英文分别为1篇[19]和10篇[20-29]；英国[20,28]、美国[21,25]各2篇(其中1篇为与巴西合作的多中心研究)，加拿大[24]、法国[26]、德国[27]、比利时[22]、新西兰[29]、塞浦路斯[23]、中国[19]各1篇。共筛查1 351 953例，以新生男婴为主；CK截断值168 ～750 U·L-1；9篇文献筛查年龄在生后1～8 d，1篇[19]在生后即刻采集脐血，1篇在生后4～6周[27]；诊断金标准为基因检测或肌肉活检；真阳性238例(单纯基因检测[19,21]6例、单纯肌肉活检[28,29]2例、基因检测或肌肉活检[20,22-27]230例)，假阳性1 257例，假阴性18例，真阴性1 350 440例。

2.3 文献偏倚风险及临床适用性评价 病例选择(领域1)中12.5%的文献UR，87.5%的文献LR，临床适用性高。待评价试验(领域2)中37.5%的文献UR，62.5%的文献LR，临床适用性高。金标准(领域3)中，38%的文献LR，62%的文献UR，临床适用性较高。病例流程和进展(领域4)中，100%的文献LR。评价表见本文附件2(http://www.cjebp.net/CN/10.3969/j.issn.1673-5501.2022.05.004)。

2.4 CK-MM筛查新生儿DMD的Meta分析 基于5项CK-MM筛查新生儿DMD研究[14-18]的敏感度对数与(1-特异度)对数的Spearman相关系数为-0.158，P=0.800，提示不存在阈值效应；Cochran’s Q=3.21，P=0.523 9，提示不存在非阈值效应引起的异质性。采用固定效应模型进行Meta分析，图2A和B显示，敏感度100%(95%CI:100%～100%)，I2=0，P=1.00；特异度100%(95%CI:100%～100%)，I2=93.92%，P=0.00；PLR 3 925(95%CI: 3 925～3 925)，I2=85.40%，P=0.00；NLR 0.00(95%CI:0.00～0.00)，I2=99.84%，P=0.00；DOR 23 094(95%CI:5 773～92 384)；图2C显示，AUC为0.925 2, Q指数为0.859 4。

图2 CK-MM筛查DMD的诊断参数

2.5 CK筛查DMD的Meta分析 基于11项CK筛查DMD的研究[19-29]敏感度对数与(1-特异度)对数的Spearman相关系数为 -0.187，P=0.581，提示不存在阈值效应；Cochran’s Q=49.14，P=0.00，提示存在非阈值效应引起的异质性。采用随机效应模型进行Meta分析，图3A和B显示，敏感度97%(95%CI:88%～99%)，I2=45.7%，P=0.05；特异度100%(95%CI:100%～100%)，I2=99.88%，P=0.00；PLR 1 131(95%CI:370～3 456)，I2=98.9%，P=0.00；NLR 0.01(95%CI:0.00～0.19)，I2=44.8%，P=0.05；DOR 16 476 (95%CI:4 115～65 963)。图3C显示，AUC为0.995 4，Q指数为0.974 0。

图3 CK筛查DMD的诊断参数

采用单变量Meta回归方式从可能影响异质性的因素(样本量、确诊的金标准、筛查人群、研究对象所处的地区、筛查时间、截断值)中寻找潜在的异质性来源，为避免漏掉重要影响因素，将检验水准α放宽至0.1，表2显示，样本量为异质性的因素(P=0.027 4)，确诊的金标准(P=0.058 5)及筛查人群(P=0.086 2)为可能的异质性因素。

表2 CK筛查新生儿DMD研究Meta回归分析结果

行亚组分析，表3显示，在11项研究中，样本量亚组的界点分别设为5万和10万时，其中的大样本(>5万和>10万)的异质性均高过小样本(≤5万和≤10万)，且有明显的异质性；金标准为基因检测异质性为0，肌肉活检可能存在异质性，基因检测或肌肉活检混合存在异质性；筛查人群为男婴有明显的异质性。

表3 CK筛查新生儿DMD研究亚组分析结果

图6显示，采用Deeks漏斗图对所纳入研究的发表偏倚进行检验，结果提示发表偏倚可能性小(P=0.12)。

图6 Deeks漏斗图检验

3 讨论

DMD基因突变可引起肌肉发生炎症和萎缩，导致CK从破坏的肌肉组织中渗漏入血液，使血清CK水平显著升高，所以CK检测一直被视为新生儿DMD筛查的重要指标[30]。本文针对CK筛查新生儿DMD的诊断试验研究进行系统评价及Meta分析，共纳入 11篇文献，发表偏倚小。Meta分析结果显示，敏感度97%(95%CI：88%～99%)，特异度100%(95%CI：100%～100%)，具有良好的检测效能。似然比能全面反映诊断试验的诊断价值，比敏感度和特异度更稳定，且不受患病率的影响[31]。PLR>10或NLR<0.1表示准确性高，本文Meta分析结果显示，每个研究的PLR均>10，合并PLR为1 131(95%CI:370～3 456)，表明筛查结果阳性时为真阳性的概率大；合并NLR为0.01(95%CI:0.00～0.19)，表明试验结果阴性时为真阴性的概率大；逐篇分析11篇文献发现，9篇[20-27, 29]NLR<0.2，准确性较高，样本量最小的2篇[19, 28]NLR为0.25，准确性一般。AUC越接近1.0，其诊断价值越高，本研究的AUC为0.995 4，Q指数为0.974 0，说明以CK为检测指标筛查新生儿DMD具有很高的准确性。

尽管CK筛查新生儿DMD的诊断参数优秀，但特异度和PLR均具有高异质性，Meta回归分析提示异质性来源为样本量，可能的异质性还包括金标准及筛查人群。

亚组分析结果显示，样本量亚组的界点分别设为5万和10万，大样本组的异质性均高于小样本组。有研究发现以I2为代表的“异质性检验”在方法学上可能存在缺陷，当纳入Meta分析的文献数量和样本量大幅增加时，I2值也稳步增加，提示I2可能仅适用于小样本量试验的异质性检验，当样本量和文献数量大幅增加时不适用[32]。

亚组分析结果也显示，金标准为可能的异质性因素，金标准为基因检测或肌肉活检混合有明显的异质性，单纯基因检测没有异质性，提示同一研究应采用同一金标准，并且诊断金标准并非固定不变，随着对疾病认识和诊断技术的进步，基因检测已逐渐替代有创的肌肉活检，成为DMD诊治指南中最新的金标准[33]。亚组分析结果还显示，筛查人群为可能的异质性因素，单纯筛查男婴组具有较高的异质性，提示今后的筛查工作应考虑开展普筛，既要确诊男性患儿，还要筛查出女性携带者[34]。

CK截断值的划分将直接影响敏感度和特异度，截断值的设置要考虑患病率因素，对于DMD截断值偏低可导致假阳性率较高，而选择较高的截断值则可能导致假阴性率高，出现漏检。Mendell等[21]研究采用600 U·L-1、750 U·L-1的高截断值，也出现较高的假阳性率；而Moat等[20]研究设置较低的截断值(250 U·L-1)，结果也出现了较高的假阴性率，提示CK检测值与DMD之间的关系尚无明确标准。本文纳入的11项研究中CK筛查新生儿DMD的截断值范围168～750 U·L-1，非常宽泛。应通过权衡假阳性和假阴性造成的后果，选择合适的截断值，并优化、完善筛查模型，提高筛查准确度，以达到筛查新生儿DMD的临床需要。

CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，其作为骨骼肌损伤的指标更具有特异性[6]。本文纳入的5篇[14-18]CK-MM筛查新生儿DMD的文献中，金标准均为基因检测，其中4篇[14-17]采用的是Perkin Elmer公司的GSP血清CK-MM 试剂盒，结果显示没有阈值效应和非阈值效应，合并敏感度和特异度均为100%，PLR为3 926>10，NLR为0.00<0.1，AUC为0.925 2, Q指数为0.859 4，提示CK-MM用于新生儿DMD筛查具有很高的准确性。

5篇文献均未报告假阴性，考虑研究起始时间为2019至2021年，而DMD通常2～3岁隐匿起病，可能随访时间尚不足。

本文的局限性: ①只纳入中英文文献；②各研究间样本量差别大；③阴性检测样本缺乏足够随访，导致研究的假阴性率可能被低估；④各研究间截断值不统一，部分未报告截断点的选择方法并说明其合理性；⑤未对筛查试验在临床应用后是否会改善临床结局进行评价；⑥未评估医生和父母对“新生儿DMD筛查”的态度以及假阳性对家庭心理因素的影响。