鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析

令狐远凤，潘 永，杨 阳，段世宇，张家莉，张宝太，杨 琦*

(1.贵州大学动物科学学院， 贵阳 550025；2.贵州大学动物疫病研究所，贵阳 550025；3.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳550025)

STM sRNA GcvB是一类重要的RNA分子，其无法编码相应的蛋白质，而是通过与Hfq协同作用，转录后调控STM有关靶mRNA[1]。现已经验证确认受GcvB直接调控的靶mRNA在STM中近30个，其中，大部分靶mRNA与GcvB的结合位点也已阐明[2]。sRNA-Hfq -mRNA三联体在细菌中普遍存在，Hfq不仅能够维持sRNA在细菌中转录后的稳定性，而且可重塑sRNA与其靶mRNA的二级结构构象，使sRNA易于与其靶mRNA结合[3]。Hfq六聚体通常利用其近端面与sRNA富含U的序列结合并作用[4]。

STM Hfq具有维持GcvB在体内稳定性的作用，但Hfq与GcvB具体的作用结合位点尚未探究透彻。鉴于此，本研究将利用RNA二级结构预测软件分析GcvB二级结构并筛查Hfq结合偏好型的富U基序；利用λ-Red同源重组酶系统构建相应序列的突变或截短菌株；利用噬菌体转导技术构建相应的hfq或gcvB基因缺失菌株以及lacZ基因融合菌株；通过qRT-PCR检测不同重组菌株gcvB基因的转录水平；通过β-半乳糖苷酶试验检测不同重组菌株oppA基因的蛋白水平，最后分析Hfq与GcvB富U基序的作用关系，为阐明STM Hfq与GcvB的作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

MA7455菌株(STM LT2/pKD46)，MA10241菌株(STM LT2 ΔgcvB::cat)，MA10675菌株(STM LT2 Δhfq::tetRA)，P22噬菌体均由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠。STM LT2oppA::lacZ菌株由本实验室构建。氯霉素、盐酸四环素、卡那霉素、dNTPs Mix及ONPG均购自北京索莱宝科技有限公司。AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。NovoScript®Plus All-in-one 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)购自近岸蛋白生物科技有限公司。

1.2 引物设计与合成

登录NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，获取STM LT2株的全基因序列(GeneID：AE006468.2), 根据基因序列设计引物(表1)，引物由Primer select软件设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物序列

1.3 GcvB二级结构预测和富U基序筛查

使用Mfold软件预测GcvB二级结构。登录网站(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)，打开RNA Folding Form (Version 2.3 energies)选项，输入gcvB基因完整序列，其余参数按默认方案设置，导出并分析结果。筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。

1.4 GcvB富U基序突变或截短菌株的构建

利用λ-Red同源重组酶系统，以P1/P2为引物，MA10241菌株总DNA为模板，PCR扩增后产物回收作为模板，P3/P10为引物，产物经纯化后与pKD46感受态细胞进行电转，在平板上培养后以P8/P9为引物鉴定其菌落，筛选出STM LT2gcvB::cat；以P4/P10为引物，PCR扩增用于替换gcvB基因内部为T的目的片段，分别以P5/P10、P6/P10、P7/P10和P8/P10为引物，PCR扩增用于截短gcvB基因T8的目的片段，用上述相同方法将鉴定正确的菌株分别命名为STM LT2gcvB(130—134TTTTT>GGGGG)::cat、STM LT2gcvBΔ(206)::cat、STM LT2gcvBΔ(205—206)::cat、STM LT2gcvBΔ(204—206)::cat和STM LT2gcvBΔ(203—206)::cat；以STM LT2gcvBΔ(204—206)::cat菌株总DNA为模板，P1/P2为引物，其产物为模板，P9/ P10为引物，以相同方法鉴定正确的菌株命名为STM LT2gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat。

1.5 P22噬菌体的转导

将鼠伤寒沙门菌MA10675和STM LT2oppA::lacZ缺失菌株作为供体菌株，GcvB 富U基序突变或截短菌株为受体菌，分别取受体菌100、50 μL稀释后供体菌borth至2.0 mL EP 管中混匀置于37 ℃摇床孵育1 h后涂布筛选，以引物P10/P11、P6/P7分别对hfq基因的缺失、oppA-lacZ融合基因进行鉴定。

1.6 qRT-PCR反应

根据R6950 Bacterial RNA Kit，提取鼠伤寒沙门菌LT2的RNA，以反转录得到的cDNA作为模板，P11/P12(gcvB基因)和 P13/P14(16S rDNA基因)为引物，按照SYBR©Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行qPCR，以16S rDNA基因为内参基因，以STM LT2gcvB::cat菌株为对照。最终采用相对比较法即Ct法(Qr=2-ΔΔCt)计算分析数据[5]。

1.7 β-半乳糖苷酶活性的检测

取50 μL待测菌株置于5 mL LB中，培养至 OD600 nm=0.4后，取0.1 mL至新试管中，以Z buffer定容到1 mL。滴加3滴甲苯后在42 ℃水浴摇床中振荡2 h，将试管转于28 ℃ 水浴锅加入0.2 mL ONPG，记录加入时间(t0)。当试管中呈现出黄色时，加入0.5 mL Na2CO3终止反应，记录终止时间(tf)。将试管中终止所得液体离心后测其OD420nm，记录数值。通过公式计算β-半乳糖苷酶活性。

β-半乳糖苷酶活性=(1 000×OD420 nm)/[(tf-t0)×OD600 nm]

2 结 果

2.1 GcvB二级结构预测及富U基序筛查结果

使用Mfold软件预测STM LT2 GcvB的二级结构。结果显示，GcvB碱基可退火形成6个茎环结构，查找到的两个Hfq结合偏好型基序，U5位于第4个与第5个茎环之间，U8位于GcvB 3′末端，且均处于单链状态。

2.2 GcvB U5基序突变菌株/U8基序截短菌株及其hfq基因缺失菌株的构建结果

利用λ-Red同源重组酶系统和噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株。以STM LT2gcvB::cat菌株DNA为模板，利用λ-Red同源重组酶系统将gcvB基因T5(130—134 nt)突变为G5,将gcvB基因T8(199—207 nt)截短。PCR鉴定结果显示，所有重组菌株均出现与预期相符的918、1 964 bp目的条带，将PCR测序后进行峰图比对，STM LT2gcvB基因T5(130—134 nt)已突变为G5，STM LT2gcvB基因T8(199—207 nt)已分别被截短突变为T7、T6、T5和T4。

2.3 gcvB T5基序突变对gcvB转录水平的影响

经过qRT-PCR试验结果显示，与野生型菌株(WT)相比，T5基序突变后gcvB基因转录水平未产生明显变化，敲除hfq基因后gcvB基因转录水平下调52%，敲除hfq基因的基础上T5基序的突变使gcvB基因转录水平下调51%。以上结果表明，hfq与gcvB基因转录水平呈正相关，但gcvBT5基序与gcvB基因的转录水平无明显关联。

2.4 gcvB T8基序截短对GcvB转录水平的影响

对gcvBT8基序截短菌株(T7、T6、T5和T4)及相应的hfq基因缺失菌株的gcvB转录水平进行检测。qRT-PCR检测结果显示，与WT相比，T7和T6菌株gcvB基因转录水平未产生明显变化，而T5和T4菌株分别下调40.5%和37.5%。敲除hfq基因的基础上截短T8基序，与WT相比，T7、T6、T5和T4菌株分别下调58.5%、57.8%、75.2%和77.8%(图1)。以上结果表明，gcvB基因T8基序的截短对其转录水平产生了抑制作用，截短为T5和T4时作用最为明显。

WT. STM LT2 gcvB::cat; gcvB-7T. STM LT2 gcvB Δ(206)::cat; gcvB-6T. STM LT2 gcvB Δ(205—206)::cat; gcvB-5T. STM LT2 gcvB Δ(204—206)::cat; gcvB-4T. STM LT2 gcvB Δ(203—206)::cat; Δhfq. STM LT2 gcvB::cat Δhfq::tetRA; gcvB-7TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(206)::cat Δhfq::tetRA; gcvB-6TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(205—206)::cat Δhfq::tetRA; gcvB-5TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(204—206)::cat Δhfq::tetRA; gcvB-4TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(203—206)::cat Δhfq::tetRA

2.5 GcvB终止子茎延伸菌株及其hfq基因缺失菌株的构建结果

利用λ-Red同源重组酶系统在gcvB基因185—186位碱基之间插入C4序列,191—192位碱基之间插入G4序列，构建GcvB终止子茎延伸菌株，在此基础上，利用噬菌体转导技术构建hfq基因缺失菌株。PCR产物测序峰图比对表明目的片段已正确构建。

2.6 终止子茎延伸对GcvB转录水平的影响

对STM LT2gcvBΔ(203—206)::cat菌株GcvB终止子茎延伸菌株及其hfq基因缺失菌株的gcvB转录水平进行检测。qRT-PCR检测结果显示，与WT相比，gcvB-LS4T终止子茎延伸菌株gcvB基因转录水平略微下调19.6%，而在此基础上敲除hfq基因后，gcvB基因转录水平下调29%。与仅敲除hfq基因时相比，gcvB-LS4TgcvBΔhfq基因转录水平上调为原来的1.6倍(图2)。以上结果表明，终止子茎的延伸与gcvB基因的转录水平呈正相关。

WT. STM LT2 gcvB::cat; gcvB-LS4T. STM LT2 gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat; Δhfq. STM LT2 gcvB::cat Δhfq::tetRA; gcvB-LS4TΔhfq. STM LT2 gcvB[ Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat Δhfq::tetRA

2.7 oppA::lacZ基因融合菌株的构建结果

以STM LT2oppA::lacZ菌株作为供体菌，STM LT2gcvB::cat、STM LT2gcvBΔ(203—206)::cat和STM LT2gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat分别为受体菌，运用噬菌体转导技术构建相应的oppA::lacZ基因融合菌株。PCR鉴定结果显示，所有重组菌株均出现与预期相符的918、914、922、250 bp目的条带(图3)。

M. DL2000 marker; 1. STM LT2 gcvB::cat oppA::lacZ; 2. STM LT2 gcvB Δ(203—206)::cat oppA::lacZ; 3. STM LT2 gcvB[Δ(203—206),(184—185)::CCCC, (192—193)::GGGG]::cat oppA::lacZ

2.8 GcvB终止子茎延伸对oppA蛋白水平的影响

通过检测oppA::lacZ基因融合菌株β-半乳糖苷酶活性，探究gcvBT8截短为T4以及延伸终止子茎对OppA蛋白表达的影响。结果显示，与WT相比，gcvB基因 T8截短为T4后，oppA基因蛋白水平上调为原来的1.7倍。延伸该菌株的GcvB终止子茎后oppA基因蛋白水平上调为原来的1.7倍。以上结果表明，GcvB终止子茎的延伸虽恢复了因gcvB基因T8基序截短为T4时gcvB基因转录水平的下调，却未恢复下调OppA蛋白表达的能力。

3 讨 论

Sauer和Weichenrieder[6]通过分析尺寸排阻色谱法证实了大肠杆菌Hfq与sRNA RybB的3′末端U6具有很高的亲和力，由于大多数Hfq依赖型sRNA 3′末端都具有4～8个尿嘧啶，该研究揭示了一种重要的Hfq与sRNA作用模式。Otaka等[4]发现截短大肠杆菌sRNA SgrS 3′末端U8时，SgrS丧失了与Hfq结合并使ptsG mRNA沉默的能力，再次证实了sRNA 3′末端polyU对Hfq结合的重要性。本研究中，对沙门菌sRNA GcvB二级结构预测，考虑到U5处于GcvB内部且在茎环结构附近，缺失将严重引起二级结构的改变从而增加了变量，不利于试验分析GcvB与Hfq之间的作用关系，因此对U5进行了突变处理，对U8进行截短处理。先前的研究已表明，Hfq主要与SgrS 3′末端U8结合，从而增强了SgrS的稳定性。试验检测了突变的U5及截短的U8菌株gcvB基因的转录水平，结果显示，U5的突变并未引起gcvB基因转录水平的显著变化，而U8的截短导致gcvB基因转录水平的明显变化，当GcvB 3′末端尿嘧啶数量缩减为5个时，GcvB转录水平开始表现出明显的下调。经初步验证，U8基序对于Hfq维持GcvB的稳定性以及协助GcvB负调控OppA的表达是必要的。

由于怀疑GcvB U8基序的缩短破坏了gcvB的转录终止进程，本研究在GcvB U8基序截短为U4的基础上延伸了U8基序前的终止子茎，与未延伸终止子茎相比，GcvB转录水平上调，几乎恢复至野生型菌株的水平，在此基础上敲除hfq基因也并未使GcvB转录水平发生明显变化，仅略微下调。但结果仍不能充分说明GcvB U8基序截短为U4GcvB转录水平下调的原因是破坏了gcvB的转录终止进程或是破坏了GcvB与Hfq结合的关键基序，研究推测两种方式均存在。而通过对oppA基因蛋白水平的检测，发现GcvB U4菌株和其终止子茎延伸菌株oppA基因蛋白水平均较野生型菌株上调，该结果提示尽管终止子茎的延伸恢复了GcvB转录水平，但其抑制oppAmRNA的翻译的能力已然丧失，而Hfq是GcvB发挥调控作用依赖的伴侣蛋白。结果进一步说明GcvB U8基序对于Hfq维持GcvB的稳定性是重要的。

4 结 论

U5基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U8基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppAmRNA以及维持GcvB稳定性来说是重要的，推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。