3株H3N2亚型禽流感病毒的基因组特征与演化分析

崔明仙，王星博，黄彦铭，卞希一，冯梦珂,颜 焰,董伟仁，周继勇

(浙江大学动物医学中心，农业农村部动物病毒学重点实验室，杭州 310058)

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)引起的一种从呼吸系统病变到严重全身败血症等多种症状的禽类传染病[1]。AIV属于正黏病毒科，流感病毒属，根据其对鸡的致病性，可分为低致病性AIV(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)和高致病性AIV(high pathogenic avian influenza virus, HPAIV)[2]。H3亚型AIV是LPAIV中分离率较高的一种亚型[3]。H3亚型流感病毒宿主范围较广，除感染禽类外，陆续发现该亚型流感病毒还能感染马、犬、猫等哺乳动物[4]。H3亚型流感病毒易发生基因重组[5]，如猪H3N2病毒在猪这个“混合器”中通过与人流感病毒发生基因重排，可形成感染人的新型猪流感病毒[6]。近三年来，赵婉宸等[7]在中国华东地区(江苏、山东和安徽)共分离到6株鸭或鹅源的H3N2亚型AIV，但未见浙江省H3N2亚型AIV的报道。因此，对浙江地区开展家禽H3N2亚型AIV 分子流行病学检测，密切关注其传播和进化情况，不仅对畜牧业生产十分重要，还具有重要的公共卫生学意义。

本试验以2021年浙江地区分离到的3株H3N2亚型AIV为研究对象，对其开展分子特征及遗传进化分析，以期为浙江乃至华东地区H3N2亚型AIV的流行病学监测提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

反转录试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；Trizol试剂、Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase等购自南京诺唯赞生物科技有限公司；9～12日龄SPF鸡胚购自宁波纯派农业科技有限公司；氯仿、异丙醇、乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；引物由浙江尚亚生物技术有限公司合成。

1.2 样品检测与分离

2021年，于浙江省四地(嘉兴、湖州、舟山、台州)采集禽类共923份咽肛拭子。采用RT-PCR技术对样品进行AIV的检测和亚型的鉴定。采用鸡胚分离法分离病毒[8]。采用鸡胚终点稀释法纯化病毒[9]，采用血凝试验(HA)和PCR法对分离到的病毒进行鉴定[10]。经PCR流感病毒HA亚型检测，只检测到单一亚型的样品用Trizol法抽提病毒RNA，并送晶能生物技术(上海)有限公司进行二代测序(Illumina NovaSeq 6000 测序平台)，对测序结果利用Burrows-Wheeler Aligner(版本 0.7.17)[11]和 SAMtools(版本 1.10)[12]进行序列的比对。

1.3 病毒全基因组序列分析

将测序结果用BLAST工具进行同源序列搜索，采用DNAStar软件中MegAlign模块进行同源性分析；对NCBI和GISAID数据库中的相关序列进行筛选，筛选标准：1)删除两个数据库中的重复序列；2)须具有完整开放阅读框。从NCBI和GISAID数据库中最终获得H3N2HA基因(717条)、H3N6HA基因(21条)、H3N2NA基因(605条)和H6N2NA基因(331条)。利用软件RAxML(版本8.2.4)[13]绘制HA和NA基因进化树，并用iTOL v4[14]进行可视化分析。

2 结 果

2.1 样品检测与病毒分离鉴定

2021年，采自嘉兴、湖州、舟山和台州的小型养殖场的鸡源咽肛拭子分别为386、294、100和30份，采自嘉兴和台州的鸭源咽肛拭子分别为3和110份，共计923份样品。AIV总阳性率为7.69%(71/923)，其中，采自嘉兴市、湖州市、舟山市和台州市样品的AIV阳性率分别为4.88%(19/389)、8.16%(24/294)、28%(28/100)和0(0/140)。鸡源样品AIV阳性率为8.40%(68/810)，鸭源样品AIV阳性率为2.65%(3/113)。从嘉兴市样品中分离到1株鸭源H3N2亚型AIV(A/duck/Zhejiang/Y1/2021, ZJ/Y1)，从湖州市样品中分离到2株鸡源H3N2亚型AIV(A/chicken/Zhejiang/57/2021, ZJ57和A/chicken/Zhejiang/64/2021, ZJ64)。

2.2 病毒全基因组同源分析

BLAST比对结果显示，2株鸡源ZJ57和ZJ64的HA基因与A/duck/Hunan/161/2015(H3N6)相似性高达94.42%，鸭源ZJ/Y1的HA基因与A/duck/Hubei/ZYSYF18/2015(H3N6)相似性为97.25%，它们均与H3N6相似度较高；3株分离株的NA基因与H6N2相似性均在96.24%以上；PB2、M基因与H1Nx相似性为97.24%和97.66%以上；ZJ57和ZJ64的PB1基因、ZJ57的NS基因、ZJ/Y1的PA基因均与H10N7对应基因具有较高相似性(表1)。3株H3N2亚型分离株之间的HA基因核苷酸相似性为93.4%～100.0%，NA基因之间的核苷酸相似性为94.0%～99.9%。

表1 3株H3N2亚型AIV分离株的BLAST分析

2.3 病毒HA和NA基因遗传进化分析

遗传进化分析表明：从宿主范围来看，H3N2亚型流感病毒的宿主范围可分为不同分支，禽源分支在遗传进化上与猪源、人源和犬/猫源均不在同一分支；H3N2亚型AIV的主要宿主为鸭(图1)；从地区分布来看，H3N2亚型流感病毒在全国均有分布，其中，H3N2亚型AIV主要流行于华东地区；从时间分布来看，AIV主要流行于2010年以后。3株H3N2亚型分离株的HA和NA基因均属于禽源分支，鸡源ZJ57和ZJ64的HA基因与A/duck/Hunan/161/2015(H3N6)遗传距离最近，而鸭源ZJ/Y1与A/duck/Hubei/ZYSYF9/2015(H3N6)遗传距离最近，鸡源ZJ57和ZJ64的HA基因与NA基因与A/duck/Guangxi/S31299/2015(H6N2)遗传距离最近，而鸭源ZJ/Y1与A/duck/Guangdong/F1172/2018(H3N6)遗传距离最近(图1)。

图1 3株H3N2亚型流感病毒HA和NA基因遗传进化树

2.4 病毒分子特征分析

2.4.1HA和NA基因分子特征分析 3株H3N2亚型AIV的HA基因编码区均由1 701个核苷酸组成，编码566个氨基酸。HA1区编码344个氨基酸，HA2区编码221个氨基酸。分离株的HA蛋白裂解位点序列均为PEKQTR↓GLF，具有典型的低致病性禽流感病毒特征。3株分离株的HA中影响流感病毒与受体特异性结合的226Q、228G、190E和225G未发生突变，位于结合位点周围的4个高度保守的残基(Y98、W153、H183、Y195)也未发生突变，提示分离株跨物种传播潜力较低。分离株HA蛋白的潜在N型糖基化位点均为6个，与浙江省禽源和人源分离株相比，存在糖基化位点增添和缺失的情况(表2)。3株H3N2亚型AIV的NA基因编码区均由1 410个核苷酸组成，编码469个氨基酸，颈部区无氨基酸缺失。NA蛋白共有5个预测的N型糖基化位点，分别为第61位(NITE)、69位(NNTI)、86位(NWSK)、146位(NGTI)和234位(NGTC)。

表2 3株H3N2亚型禽流感病毒HA蛋白N型糖基化位点预测

2.4.2 内部片段基因分子特征分析 3株H3N2亚型禽流感分离株PB2蛋白中与哺乳动物适应性相关的第627位关键位点均为Glu，符合禽流感特征，而人源A/Homosapien/China/LS340/2019(H3N2)株为Lys。PB1蛋白中与哺乳动物致病性相关的第66位氨基酸位为Ser(人源H3N2为Leu)，而PB2中在跨物种传播起关键作用的701位氨基酸位点、PB1蛋白中与小鼠致病性相关的第198和317位氨基酸位点、PA蛋白中能使毒力增强的第97位氨基酸位点、M1蛋白中能增强病毒对小鼠致病性的第30和215位氨基酸位点均未发生突变。

3 讨 论

AIV为单股负链RNA病毒[15]，由于其在RNA复制过程中缺乏校对机制，导致点突变频率很高。除通过快速突变产生遗传多样性外，同源重组是另外一种重要的进化机制，它驱动病毒基因变异的形成，使AIV能够克服选择压力而适应新的环境和宿主[16]。本研究结果显示，已报道的H3N2亚型AIV主要流行于2010年后，集中分布在华东地区，鸭是其主要宿主。分离株各基因片段来源复杂，说明它们可能是经过长时间进化而发生自然重排后形成的重组病毒：分离株的HA基因与湖南和湖北两地H3N6亚型毒株距离较近，ZJ57和ZJ64的NA基因与广西的H6N2毒株遗传关系较近，ZJ/Y1与广东的H3N6毒株遗传距离最近，进一步说明3株H3N2亚型AIVs片段来源较复杂，可能发生了基因重组。

流感病毒受体结合特异性会影响其跨物种传播。人H3流感病毒HA蛋白226L和228S特征使其优先与人细胞表面的α2-6半乳糖苷唾液酸(SAα2-6Gal)受体结合，而禽源优先与α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)受体结合[17]，PB2中的627E和701K氨基酸位点也在流感病毒跨种间传播中起关键性作用[18]。本研究中3株H3N2亚型禽流感病毒分离株HA蛋白的226Q和228G特征表明其更倾向于结合禽源的SAα2-3Gal受体，提示分离株的跨物种传播潜力较低。PB2蛋白序列中与哺乳动物适应性相关的第627位关键位点均为Glu，符合禽流感病毒特征。PB1中的66S、198K和701M氨基酸位点，M1中的30D和215A能增强流感病毒致病性[19-22]。但PB1蛋白中第66位氨基酸位点均由Leu突变为Ser，但是否会增强对哺乳动物的致病性还需进一步验证。

禽流感病毒HA和NA蛋白都修饰有N-连接寡糖(N型糖基化位点)[23]，流感病毒HA蛋白头部的糖基化位点的结构和数量不相同，是导致病毒抗原多样性的一个重要原因，它能够掩盖或者修饰抗原位点，减少先天免疫系统给病毒的生存压力[24]。本研究发现浙江人源A/Homosapien/China/LS340/2019(H3N2)株HA蛋白和NA蛋白的糖基化位点较丰富，而禽源A/duck/Zhejiang/D13/2013(H3N2)[25]糖基化位点相对较少，3株分离株的糖基化位点均存在不同情况的缺失和增加，其是否会对病毒抗原多样性造成影响还需进一步探究。

4 结 论

2021年，浙江地区禽流感阳性率为7.70%，分离到3株H3N2亚型AIVs，其基因片段来源复杂，推测可能由不同亚型毒株经过长时间进化而发生自然重排后形成。因未发生与哺乳动物适应性位点相关的突变，表明其跨种传播潜力较低，但PB1中66位氨基酸突变为S，其是否会增加哺乳动物的致病性仍需进一步探究。