环状RNA TADA2A在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响*

符仲标 陈 琼 王 勇 刘昌江 唐明亮 吴智明

海南医学院第二附属医院 (海南 海口， 570311)

近10年来，我国的肝癌发病人数占全球肝癌的55%，依然位居榜首，且5年生存率无明显提高[1]。而肝癌位于我国恶性肿瘤发病谱第4位，死亡率第2位，因此肝癌的防治形势还是相当严峻[2]。针对肝癌的治疗，现如今还是以传统放化疗为主，但是已逐渐进入瓶颈期，效果不甚理想。因此探索肝癌的新型疗法是一项艰巨但很有意义的任务[3,4]。近几年，环状RNA(circ RNA)应用于肝癌治疗的研究探索越来越多，并已逐渐成熟[5-7]。Circ RNA是一类非经典剪接方式、缺少多聚腺苷酸尾的内源性闭环非编码RNA,具有高度的稳定性和保守性,在多种疾病特别是恶性肿瘤中常常异常表达[8-10]。研究发现，circTADA2A可在肺癌、骨肉瘤、结肠癌等多种恶性肿瘤中异常表达，对疾病有着一定的诊断价值[11-13]。但是circTADA2A在肝癌中的表达及作用还没有明确，因此本研究主要探索circTADA2A在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年10月至2020年12月入住我院的80例肝癌患者的相关资料，包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤T分期、分化程度等临床资料，同时采集患者距肝癌病灶约2 cm外的癌旁组织作为对照。纳入标准：①诊断为原发性肝癌； ②尚未接受治疗；③ 无高血压、糖尿病等重大慢性疾病；排除标准：①病程已进入晚期，并伴随癌细胞大面积转移；② 患者本人及家属拒绝参与该研究。本研究经本院伦理委员会批准，患者均已知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要材料

名称来源人肝癌HepG2细胞美国ATCC细胞库pCDNA3.1-circTADA2A过表达质粒上海生工pCNDA3.1空白质粒上海生工RT-qPCR试剂盒日本TaKaRa公司Anti- Casapase3抗体美国CST公司Anti- GAPDH抗体美国CST公司反转录试剂盒日本TaKaRa公司circTADA2A及GAPDH引物上海生工Lip3000转染试剂日本TaKaRa公司

1.3 RT-qPCR法检测肝癌组织和癌旁组织的circularTADA2A表达水平 首先利用TRIzol法提取组织中的总RNA，分光光度计检测RNA的浓度和纯度。随后进行反转录(RT-PCR)合成cDNA，反转录反应体系为：上游与下游随机引物(10 pmol/L)各2 μl，dNTP(2 mM)4 μl,10×PCR butter 5 μl，Taq酶(2 u/uL)1 μl，加入水至体积为50 μl；主要程序为：25℃ 10 min,37℃ 60 min,70℃ 10 min。获得cDNA后进行qPCR，其中circTADA2A上游引物序列为：5′-TGTGCACCAAGACCTTCGAG-3′，circTADA2A下游引物序列5′-AGGAAGGCCTGAAGTAGTGA-3′;GAPDH上游引物序列为：5′-ACAGCATTCAGACCGGAGAG-3′,GAPDH下游引物序列5′-TTCAGGCCTGAAGTAGCAC-3′,采用2-△△Ct法计算 circTADA2A 的相对表达量。qPCR反应体系为：2×SYBR Mixture(1×)25 μl，上游引物(10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 2 μl，加入水至体积为50 μl；主要程序为：95℃ 5 min，95℃ 15s-60℃ 1 min-72℃ 30 s(35个循环)，4℃ 5 min。

1.4 瞬时转染circTADA2A过表达质粒 培养人肝癌HepG2细胞2盘(100 cm2)，待达到50%～60%的密度，将1 μg空白质粒和circTADA2A过表达质粒分别与3 μl Lip3000转染试剂预混，静置15 min后加入人肝癌HepG2细胞，放置于5% CO2,37℃培养箱培养24 h。

1.5 Western blot检测人肝癌HepG2细胞凋亡指标Casapase3 收取转染后的细胞，裂解后提取蛋白，SDS-PAGE电泳60 min，半干转转印120 min后，牛奶封闭60 min，抗体孵育，发光显色检测凋亡指标Casapase3相对表达量。

2 结果

2.1 circTADA2A在肝癌组织及癌旁组织中的表达 见表1。

表1 circTADA2A在肝癌组织及癌旁组织中的表达比较

2.2 circTADA2A表达与肝癌组织临床病理特征的关系 见表2。

表2 肝癌组织临床病理特征与circTADA2A表达的关系

2.3 瞬时转染质粒的凋亡指标Casapase3表达 将转染空白质粒和circTADA2A过表达质粒的人肝癌HepG2细胞提取蛋白后，进行Western blot检测人肝癌HepG2细胞凋亡指标Casapase3。结果显示，circTADA2A过表达的HepG2细胞凋亡指标Casapase3相对表达量明显低于空白对照HepG2细胞(3.106±0.346<5.552±0.145，t=9.265，P=0.015)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：空白质粒组 B：circTADA2A过表达组

3 讨论

近年来发现，环状RNA是一类共价封闭的非编码RNA，可调控真核生物的基因表达。环状RNA在恶性肿瘤中常可异常表达，这可能为恶性肿瘤的临床诊断和治疗提供一定的帮助[14，15]。已发现环状RNA TADA2A在肺癌、结肠癌及乳腺癌中呈异常表达，并且可以辅助多种恶性肿瘤的初步诊断和临床治疗[12,16，17]。但是环状RNA TADA2A在肝癌中的表达及作用，还没有被明确研究结果。

因此，本研究通过探索环状RNA TADA2A在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响来明确其在肝癌组织中的表达及临床作用,以期对肝癌的临床诊断和治疗提供一定的帮助。本研究发现肝癌组织中环状RNA TADA2A较癌旁组织表达明显增高，且差异有统计学意义(P<0.05)。这说明在肝癌组织中，环状RNA TADA2A有异常的高表达。与此同时，我们又发现环状RNA TADA2A与肿瘤T分期和分化程度显著相关，这说明RNA TADA2A表达高低与肝癌某些临床病理特征相关。最后，我们发现，环状 RNA TADA2A过表达的HepG2细胞凋亡指标Casapase3相对表达量明显低于空白对照HepG2细胞，这表明环状 RNA TADA2A过表达可以抑制人肝癌HepG2细胞凋亡，这与肝癌组织中环状 RNA TADA2A高表达相吻合。但是，本研究的患者例数较少，并且未指明环状RNA TADA2A在肝癌中异常高表达的具体分子学机制。因此本研究有一定的局限性，有待于后续进一步探索。

综上，circTADA2A在肝癌组织中的高表达，并且与肿瘤T分期及分化程度呈显著相关性，同时可以抑制人肝癌HepG2细胞凋亡，这为临床上肝癌诊断和治疗提供了一个新的思路。