雷公藤甲素对正常及荷瘤小鼠肝毒性的比较研究*

卫博文 李 城 张天娇 魏佩煌 李 诺 李 健

北京中医药大学中医学院 (北京， 100029)

雷公藤是卫矛科植物，其木质部入药，性味苦、寒，归肝、肾经，有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒的功效[1]。现代药理学研究表明，雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素(triptolide)具有抗炎、免疫调节等药理作用[2]。近年来，越来越多的研究结果证实雷公藤甲素具有较强的广谱抗肿瘤活性[3]，但其药效与毒性难以分离，部分患者因使用不当可出现不同程度的肝损伤、肾损伤、生殖毒性等副反应[4]。

本课题组的前期研究发现，雷公藤多苷对正常和病理状态机体毒性反应存在差异[5,6]，与《黄帝内经》中“有故无殒”理论相符合，为进一步研究其 “毒-效”相关性，本课题以CT26结肠癌小鼠为实验研究对象，在评价雷公藤甲素抗肿瘤作用的同时，观察比较其对正常及荷瘤小鼠的肝毒性反应，并初步探讨其机制，为雷公藤的临床应用及深度开发提供更多的资料。

1 材料和方法

1.1 实验细胞及实验动物 CT26 WT细胞株(ATCC ® CRL-2638TM)，购自中国医学科学院细胞中心，DMEM培养基(10%胎牛血清、1%双抗)常规培养；BALB/c小鼠，5～6周龄，清洁级，雄性，购自北京维通利华实验动物公司。

1.2 实验仪器及试剂 自动脱水机ASP300S，德国LEICA；BD FACSCanto Ⅱ电子天平，德国Sartorius AG；HistocoreArcadia H包埋机，德国LEICA ；DM3000正置显微镜，德国LEICA；RM2265超薄切片机，德国LEICA；DW-86L729 -86℃超低温保存箱，中国海尔。Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒，购自赛默飞世尔科技(Thermo)公司；CCK-8试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒及GSH-PX试剂盒均购自南京建成生物公司；iNOS及Nrf2抗体，Abcam产品。

1.3 实验药物 雷公藤甲素，购自南京泽朗医药科技有限公司(纯度≥99%)；

1.4 雷公藤甲素体内外抑瘤实验

1.4.1 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 CT26细胞接种于96孔板，5 000/孔，孵育24 h后给药，经雷公藤甲素(50 nM)处理24 h后用CCK-8试剂盒测定不同处理组CT26细胞450 nm处吸光度并计算细胞的增殖抑制率，计算公式：细胞增殖抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%(A表示吸光度)。

1.4.2 伤口愈合实验检测细胞迁移能力 CT26细胞接种于6孔板，待细胞融合至70%～80%时，用1 ml吸头垂直于培养板底部划痕并给予雷公藤甲素(50 nM)处理，于0 h、24 h观察并拍照，用Image J测量划痕之间的距离比较不同处理组对细胞迁移的影响并计算细胞迁移抑制率，计算公式：细胞迁移抑制率=(1-L实验组/L对照组)×100%(L表示迁移距离)。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 CT26细胞种于6孔板，孵育24 h后加药，经雷公藤甲素(50 nM)处理24 h后用细胞凋亡试剂盒和流式细胞术检测并计算不同处理组对CT26细胞凋亡的影响。

中国人的消费水平有豪华型、富裕型、一般型、困难型、贫困型五个层次，其中后三种为平民消费，因此,在设计夜游项目时,要考虑到消费层次的多样化，既要有高端夜游产品,如音乐会、讲座、沙龙等，也要有适合平民消费的旅游产品,如广场休闲、商业街购物等。如今,夜游活动趋向大众化，不同年龄阶段的人群均参与夜间旅游，考虑到不同年龄消费群体的不同特征，夜间旅游活动既要有适宜年轻人群消费的KTV、酒吧、健身所等时尚场所，又要有适合中老年人群的公园、河湖等较为宁静的场所。总之，在夜游产品的设计上应有动有静、有高端有低端，以满足消费群体的多样化需求。

1.4.4 荷瘤小鼠模型的建立、分组给药及肿瘤体积和重量的测量 BALB/c小鼠随机分为空白对照组、肿瘤模型组、雷公藤甲素干预组(每组20只)。常规细胞培养扩增CT26细胞，收获对数生长期细胞、计数后接种于肿瘤模型组和雷公藤甲素干预组小鼠右前肢下的皮下部位，建立皮下荷瘤小鼠模型(1×107个/100 μl)，空白对照组小鼠皮下注射等剂量溶剂(0.01 M PBS)。雷公虅甲素干预组小鼠自移植肿瘤细胞当天腹腔注射雷公藤甲素(0.4 mg/kg)，空白对照组和肿瘤模型组给予同等体积的蒸馏水，连续给药25天。自移植肿瘤第6天，用游标卡尺测量荷瘤小鼠皮下肿瘤的长度和宽度并计算体积。取材时剥离皮下肿瘤，称重、拍照，计算抑瘤率。

1.5 雷公藤甲素对正常及荷瘤小鼠的肝毒性反应

1.5.1 血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)的检测 收集小鼠血液4℃冰箱静置4 h，4℃，3 000 rpm/min离心10 min，分离血清，釆用比色法，全自动生化分析仪依照常规方法检测血清中ALT的含量。

1.5.2 肝组织匀浆液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的检测 依照试剂盒内的操作说明书进行检测。

1.5.3 肝组织病理学观察 依照常规方法制备肝组织石蜡切片，HE染色、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及核转录因子E2相关因子2(Nrf2)免疫组化显色，光镜观察并摄片分析。

2 结果

2.1 雷公藤甲素的体内外抑瘤作用

2.1.1 雷公藤甲素的体外抑瘤作用 采用CCK-8法检测雷公藤甲素对CT26细胞增殖的抑制作用，结果显示：与空白对照组相比，雷公藤甲素组(50 nM)对CT26细胞的增殖抑制率显著升高，24 h抑制率为51.46%(图1B)。伤口愈合实验结果表明，雷公藤甲素(50 nM)处理CT26细胞24 h能显著抑制CT26细胞的迁移行为(图1A)。流式细胞术检测结果表明，雷公藤甲素能显著诱导CT26细胞凋亡(图1C,D)。

图1 雷公藤甲素的体外抑瘤作用 注：A.伤口愈合实验检测CT26细胞迁移能力；B.CCK-8检测CT26细胞增殖抑制率；C.D.流式细胞术检测CT26细胞凋亡

2.1.2 雷公藤甲素的体内抑瘤作用 见表1、2。

表1 小鼠肿瘤体积变化

表2 小鼠皮下肿瘤重量

2.2 雷公藤甲素对正常及肿瘤小鼠的肝毒性反应

2.2.1 各组小鼠血清中ALT含量 见表3。

表3 各组小鼠血清中ALT含量

2.2.2 各组小鼠肝组织匀浆液中MDA、SOD、GSH-PX表达见表4。

表4 各组小鼠肝组织匀浆液中MDA、SOD、GSH-PX表达

2.2.3 肝组织HE染色 正常对照组及肿瘤模型组小鼠的肝组织内可见完整的肝小叶结构，其肝索排列整齐、肝细胞形态正常，未见明显异常变化(图2-A,B)；正常+雷公藤甲素组小鼠肝小叶结构消失，肝索排列紊乱，肝细胞形态异常，如肝细胞体积增大、肿胀变圆，胞浆空亮，细胞界限不清，大量炎性细胞浸润(图2-C)；肿瘤+雷公藤甲素组小鼠出现细胞肿胀，炎性细胞浸润等变化(图2-D)，但其肝小叶结构损伤程度轻于正常+雷公藤甲素组。

2.2.4 免疫组化法检测肝组织中iNOS表达情况 与正常对照组及肿瘤模型组比较，雷公藤甲素处理后小鼠肝组织中iNOS的平均光密度值均显著增加，且正常组高于肿瘤组(P<0.05或P<0.01，图3，表5)。

图2 肝组织HE染色(× 200) 注：A.正常对照组；B.肿瘤模型组；C.正常+雷公藤甲素组；D.肿瘤+雷公藤甲素组

图3 肝组织中iNOS的表达情况(× 200) 注：A.正常对照组；B.肿瘤模型组；C.正常+雷公藤甲素组；D.肿瘤+雷公藤甲素组

表5 肝组织中iNOS表达的平均光密度值

2.2.5 免疫组化法检测肝组织中Nrf2表达情况 与正常对照组及肿瘤模型组比较，雷公藤甲素处理后小鼠肝组织中Nrf2的平均光密度值均显著增加，且正常组高于肿瘤组(P<0.05或P<0.01，图4，表6)。

表6 肝组织中Nrf2表达的平均光密度值

图4 肝组织中Nrf2的表达情况(× 200) 注：A.正常对照组；B.肿瘤模型组；C.正常+雷公藤甲素组；D.肿瘤+雷公藤甲素组

3 讨论

本研究以CT26结肠癌细胞及荷瘤小鼠为研究对象，探讨雷公藤甲素对生理状态及病理状态小鼠的肝毒性反应。实验结果表明：雷公藤甲素在一定程度上抑制CT26细胞的生长增殖、迁移，诱导细胞凋亡，同时，在动物体内可显著影响CT26皮下移植瘤的生长。雷公藤甲素可导致小鼠血清中ALT、肝组织匀浆液中MDA、SOD、GSH-PX表达显著增加，肝组织损伤明显，iNOS表达水平增加，且正常组的肝组织损伤程度明重于肿瘤组。免疫组化结果显示，雷公藤甲素处理后小鼠肝组织中Nrf2表达显著增加，提示雷公藤甲素的肝毒性发生机制与诱导氧化应激有关。

iNOS表达情况可间接评价雷公藤甲素对肝组织的损伤作用，iNOS产生的细胞毒性一氧化氮(NO)与超氧离子结合产生细胞毒作用，加重肝组织的损伤[7]。而氧化应激状态下，线粒体呼吸链受到抑制，谷胱甘肽(GSH)及抗氧化酶(GST、GSH-PX、SOD等)表达降低， MDA活力增强[8]，Nrf2被激活，发挥对机体氧化应激损伤的防御保护作用[9]。

雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，属于三环氧二萜内酯类化合物。近年来研究显示，雷公藤甲素具有广谱抗肿瘤活性，能对60余种肿瘤细胞株有抑制作用。然而雷公藤甲素存在一定的毒副作用，临床上部分患者出现肝损伤、肾损伤、生殖毒性等不良反应[4]。

中药通常在“辨证论治”“因人制宜”等中医理论的指导下使用[10]，其毒副作用随着机体状态或疾病状态而变化。某些中药可能对正常状态的机体有毒副作用，但对病理状态的机体没有或仅有轻微的毒副作用，即“有故无殒”。“有故无殒”理论源自《黄帝内经》，《素问·六元正纪大论》云：“妇人重身，毒之何如…… 有故无殒，亦无殒也”，是有毒中药合理使用的逻辑基础。“有故无殒”理论一方面强调要对“病证”状态使用中药，另一方面也强调应重视 “中病即止”，该理论有助于理解中药临床不良反应的生物学本质。

2011 年肖小河教授课题组发表了大黄提取物毒效相关性的研究成果，其结果表明大黄提取物对正常大鼠具有明显的肝脏毒性，而对CCL4诱导肝损伤大鼠则表现出显著的肝保护作用，为中医“有故无殒”理论提供了确凿的实证资料[11,12]。本课题组前期研究也发现不同剂量雷公藤多苷对正常大鼠和佐剂关节炎大鼠生殖、肝、肾等组织及细胞的毒性差异[6]，因此提出了对证控毒的研究策略，即中药通常存在“毒-效”二重性；中药毒效关系的研究应在“病证”状态下[13]。

综上，本研究通过离体实验和整体实验发现雷公藤甲素具有显著的抗肿瘤作用，且相同剂量下，在荷瘤小鼠体内产生的肝毒性反应较正常小鼠轻。