细胞焦亡在糖尿病及并发症中的研究进展

陆阁玲，郭文海，王 宁，刘春红，姜 北，邢 菁，徐 佳，马伯艳

(1． 黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

流行病学调查显示，糖尿病(diabetes mellitus，DM)业已成为导致成人死亡的十大原因之一[1]。预计2030年全球DM患病人数将达5.78亿，2045年将上升至7亿，而中国位居全球DM发病率榜首[2]。DM的病理机制十分复杂，近年研究表明炎性因子在DM进程中具有至关重要的作用[3]。细胞焦亡是近年新定义的有异于细胞凋亡、自噬、坏死的新型细胞死亡形式，1992年由Zychlinsky等首次在弗氏志贺菌感染的巨噬细胞中发现，并于2001年由Cookson等将其命名为“Pyroptosis”。细胞焦亡的形态学表现为细胞核皱缩、DNA裂解、TUNEL和Annexin V检测染色阳性等类似于凋亡的特征，但不同于凋亡的是细胞焦亡时的细胞膜会形成众多孔隙，细胞不断胀大，内容物及细胞炎性因子释放，进而激活炎症[4]。一般认为这一程序性细胞死亡过程由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide oligomerization domain-like receptor protein-3，NLRP3)介导、caspase家族依赖、GSDMD、GSDME所执行，该过程可释放炎性因子进而放大炎症效应[5]。研究表明细胞焦亡引发的炎性反应是DM及其并发症发生发展的重要损伤机制，在既已取得研究基础上，如何纠正和平衡过度的细胞焦亡，如何恢复其作为存在于体内的保护机制，减少DM及其并发症的发生，是防治DM及其并发症的又一新切入点[6]。本文将就近年有关细胞焦亡及其与DM及并发症的相关研究进展加以概述。

1 细胞焦亡

1.1细胞焦亡传感器(Sensors)-NLRP3炎性小体研究证明，细胞焦亡主要特点是由Caspase-1受胞内多蛋白复合物炎性小体调控而活化介导的，即细胞焦亡在外源性相关病原体分子模式作用下，通过不同信号途径作用于炎症小体，可见多蛋白复合结构的炎性小体是细胞焦亡发生机制的传感器，包括NLRs家族(NLRP1、NLRP3、NLRP7和NLRC4)、PYRIN和AIM2炎性小体，在炎症反应发生和维持中起重要作用。NLR家族成员中NLRP3炎性小体在细胞焦亡领域关注度最高，NLRP3炎性小体的过度激活是多种炎性疾病发生发展的推手，譬如肿瘤、DM、痛风、高血脂症、肥胖等代谢性疾病及呼吸系统疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病、炎症性肠病、感染性疾病等[7-9]，目前研究已逐渐由对NLRP3炎性小体激活后所致的信号转导进行干预进展到抑制NLRP3寡聚和激活从而降低细胞焦亡水平，并利用这一机制为治疗多种相关疾病提供新靶标。

Cullin1作为Cullin家族中具有代表性的成员之一，在细胞周期、转录和信号转导相关蛋白泛素化中至关重要，新近研究发现Cullin1可促进NLRP3泛素化，进而抑制NLRP3炎症小体激活[10]。另外线粒体可为未激活的NLRP3在应激时提供激活组装结合位点；并且线粒体在供给细胞产能过程中产生和释放活性氧(ROS)、mtDNA，二者分别通过进入胞质、作为DAMP而激活NLRP3炎性小体[11]。NLRP3炎性小体激活过程不可或缺的途径除ROS信号、K+外流和溶酶体不稳定外，无丝分裂基因A相关蛋白激酶7(NIMA related kinase 7,NEK7)在NLRP3炎性小体激活中同样必不可少。且其仅调控 NLRP3炎性小体激活，不调控引发细胞焦亡的其他炎性小体的激活[12]。研究表明通过miR-23a-3p负调节NEK7，可抑制NLRP3炎性小体激活及细胞焦亡产生的炎性反应，用于治疗T2DM[13]。二甲双胍可抑制db/db小鼠牙龈组织中NEK7/NLRP3信号通路，减少细胞焦亡，改善糖尿病性牙周炎[14]。造血细胞激酶活性抑制剂A419259在体内抑制巨噬细胞和小胶质细胞的NLRP3炎性小体、Caspase-1激活及IL-1β释放，内源性抑制造血细胞激酶活性可以减轻脂多糖(LPS)诱导的小鼠肝脏炎症反应[15]。此外有研究表明，抑制NLRP3炎性小体及其下游通路激活在脓毒症及其引发的多器官功能障碍至关重要[16]。由此可见，进一步明确调控NLRP3炎性小体激活的多种机制有望为相关疾病的治疗提供可靠的新靶点，并且抑制NLRP3炎性小体激活进而调控后续的级联反应仍然是治疗慢性、急性乃至危重炎性疾病的一个新突破口。

1.2细胞焦亡衔接子(Adatpors)-Caspase家族 在细胞焦亡领域，除已达成共识的Caspase-1、Caspase-4/5/11外，Caspase-3、Caspase-8对该程序性细胞死亡过程至关重要，但具体作用机制以及是否能成为抑制细胞焦亡的有效作用靶点还有待进一步研究。Caspase-1在细胞焦亡经典途径中炎性小体激活并引发炎性反应的过程起衔接作用。焦亡非经典途径中，细胞外LPS由Toll样受体4(TLR4)识别，TLR4通过MyD88和TRIF信号通路诱导细胞因子产生。细胞内LPS被非经典炎性小体识别，激活Caspase-4/5/11，LPS作用于Caspase-4/5/11的CARD端，使Caspase-4/5/11寡聚激活，进而切割GSDMD的N端进入酯酰基醇-4,5二磷酸结构域，与细胞膜结合，形成小孔，炎性因子由此释放。此前有报道Caspase-11的激活需要I型干扰素(IFN)诱导的鸟苷三磷酸酶(GTPases)表达，其中包括鸟苷酸结合蛋白(GBPs)或与免疫相关的GTP酶(IRGs)[17]。IFN诱导蛋白Irgm2和ATG8家族成员Gate-16协同可抑制Caspase-11与LPS相互作用，抑制非经典通路激活[18]。最近研究发现IFNγ和GBPs的诱导作用对于人上皮细胞和单核细胞中Caspase-4至关重要，其中GBP1与GBP4一同募集Caspase-4，GBP3是Caspase-4激活所必需的[19]。最近研究表明Caspase-8在细胞焦亡中也发挥重要作用，当Caspase-1通路被阻断时，Caspase-8同样可激活NLRP3炎症小体组装，并裂解GSDMD的N端成孔结构域(NTD)[20]。另外，作为细胞焦亡与细胞凋亡共同的关键蛋白Caspase-3，可切割GSDME介导细胞焦亡，但这一通路并不属于细胞焦亡经典/非经典通路[21]。

1.3细胞焦亡效应子(Effectors)-GSDM GSDM家族在细胞焦亡领域研究最为广泛的是GSDMD，GSDMD通过N、C两端结构域裂解分离而激活，具有细胞膜孔形成活性，是炎症发生的关键介质，GSDMD作为Caspase-1下游关键因子，对细胞焦亡过程炎性因子的释放至关重要，被认为是细胞焦亡效应器[22-23]，研究表明干扰素调节因子(IRF)转录因子之一IRF2是GSDMD转录必需因子，IRF2缺乏可抑制经典、非经典通路下发生的细胞焦亡、阻止IL-1β释放到胞外[24]。另外值得关注的是，Caspase-3切割GSDME产生的GSDME-N也具有胞膜成孔活性，可使线粒体、质膜透化、胞膜成孔，引发细胞焦亡并扩大炎性反应[21-25]，目前Caspase-3/GSDME这一通路已逐渐在肿瘤治疗的相关研究中展开，有望成为治疗肿瘤的新方向[26]。

2 细胞焦亡与糖尿病及其并发症

2.1细胞焦亡与糖尿病相关性的研究进展 1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)以胰岛β细胞功能障碍和胰岛素分泌缺陷为特征。新近研究表明，在胰岛β细胞中激活的Caspase-4和内质网应激促使GSDMD裂解激活引发焦亡，是人类β细胞潜在的免疫反应机制，该机制可能是T1DM初始阶段β细胞死亡的原因之一[27]。在链脲佐菌素(STZ)诱导T1DM小鼠胰腺组织中，因线粒体介导的NLRP3激活触发了Caspase-1依赖细胞焦亡释放IL-1β，驱动Th17/Tc17/Th1致病性应答，负调节胰腺淋巴结的肥大细胞和来源于髓系抑制细胞介导的耐受反应，导致T1DM的发生[28]。

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)中胰岛素抵抗(IR)和胰岛素绝对或相对分泌缺陷是发病的关键机制，细胞焦亡与上述T2DM的病理改变均存在密切相关性[29-30]。研究表明，60%脂肪供能高脂饲料喂养C57BL/6小鼠10周，其脂肪组织中Caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD、IL-1β等细胞焦亡相关分子表达水平显著增高，脂肪组织胰岛素敏感性降低，进一步导致TNF-α诱导3T3-L1细胞建立IR细胞模型中焦亡相关分子表达水平升高[31]，证明脂肪组织、细胞发生焦亡引发的炎症效应与IR密切相关。在以肝胚胎瘤细胞株(HepG2细胞)建立IR模型中发现激活NLRP3和Caspase-1可抑制胰岛素作用的下游信号通路，加剧IR，但HepG2与人脐带骨髓间充质干细胞(UC-MSCs)共培养则可抑制NLRP3激活及IL-1β释放并提高胰岛素敏感性、提高葡萄糖消耗率，T2DM大鼠给予UC-MSC可改善其高血糖状态和IR[32]。此外，细胞焦亡不仅易导致胰岛素靶组织内发生IR，释放的IL-1β，还可影响胰岛素受体底物1(IR-1)酪氨酸磷酸化而抑制IR-1基因表达造成IR[33]。另一方面胰岛β细胞受高糖毒性以及脂毒性引发氧化应激影响，引发β细胞焦亡使胰岛素分泌减少，降低靶组织对胰岛素的敏感性，加重IR，促使T2DM发生发展[34]。

研究发现DM的慢性高血糖及其相关危险因素如游离脂肪酸(FFA)、ROS、尿酸和内质网应激，可作为DAMPs激活NLRP3炎性小体引发细胞焦亡，并在疾病过程中产生促炎的级联反应[35]。T2DM患者白细胞中总ROS和线粒体ROS产生增加，尤其血糖控制不佳者(HbA1c≥8%)ROS生成更为显著[34]，ROS与NLRP3炎性小体激活及其引发的细胞焦亡和因子释放密切相关。另外有临床研究表明在DM患者的肝脏缺血再灌注损伤中通过促进氧化应激介导的NLRP3小体激活诱导肝脏细胞焦亡[36]。总之，细胞焦亡伴随炎性反应的过程在T1DM、T2DM发生发展中作为损伤机制存在，该过程中NLRP3炎性小体的组装激活是“罪魁祸首”，同时与炎性因子释放密切相关，抑制NLRP3炎性小体的活化、阻止炎性因子释放可能是治疗DM行之有效的方式之一。

2.2细胞焦亡与糖尿病并发症相关性的研究进展DM作为一种全身性疾病，可因IR、高血糖、慢性炎症状态等并发眼、肾脏、心血管系统、神经系统等慢性损害。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是DM的代表性并发症，为成人视力丧失的主因。研究表明高糖状态下的人视网膜微血管内皮细胞经硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)或 NLRP3siRNA 处理后，NLRP3和细胞炎性因子基因表达水平显著上调，沉默大鼠模型和人视网膜微血管内皮细胞中NLRP3可改善炎性因子表达，沉默TXNIP可使NLRP3炎症小体活化趋于正常，缓解DR发生发展[37]。新近研究发现长链非编码RNA心肌梗死相关转录本(myocardial infarction-associated transcript,MIAT) 除与心肌梗死高度相关外，在视网膜细胞发育中起到重要作用，MIAT是DR微血管功能障碍的重要调节因子，利用视网膜周细胞(HRPCs)建立DR细胞模型，其中MIAT的表达显著上调，并吸附miR-342-3p，增加Caspase-1表达，Caspase-1切割GSDMD、IL-1β、IL-18和乳酸脱氢酶释放，证实HRPCs发生Caspase-1介导的细胞焦亡，导致HRPCs存活率下降[38]。Gan等[39]研究得到类似的结果，发现高糖状态下通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD机制诱导的细胞焦亡可导致HRPCs缺乏。另外有研究表明在高糖诱导的视网膜色素上皮细胞中，上调miR-130a可降低TNF-α/SOD1/ROS轴介导的细胞焦亡，减轻高糖对ARPE-19细胞的细胞毒性作用[40]。

已有研究证实，糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)的发生发展与细胞焦亡密切相关[41]。DKD的肾足细胞内的Caspase-11和GSDMD水平显著升高，炎性因子水平升高，足细胞标志物Neparin和Podocin表达降低，但于Caspase-11或GSDMD的基因敲除后肾足细胞内NF-κB、IL-1β和IL-18表达水平下降，证实Caspase-11和GSDMD介导的细胞焦亡参与肾足细胞损伤及DKD发展[42]。A20是由TNF-α诱导蛋白基因编码的蛋白之一，在炎症调节中起重要作用，研究证实巨噬细胞源性胞外囊泡中的miR-21-5P可通过A20调节细胞焦亡介导DKD足细胞损伤[43]。有学者在DKD的细胞模型HK-2细胞内发现Gas5过表达下调miR-452-5p，可抑制NLRP3表达及炎性因子释放，降低细胞焦亡和氧化应激的发生[44]。DKD大鼠肾功能受损过程中TXNIP与NLRP3可直接作用，TXNIP/NLRP3轴被激活，导致细胞焦亡和炎性反应[45]。Wang等[46]在HK-2细胞中发现miR-497在TXNIP和ANRIL上具有结合位点，并证实ANRIL结合miR-497，进而miR-497结合TXNIP，引发NLRP3炎性小体组装，激活Caspase-1引发细胞焦亡，通过敲除ANRIL基因抑制后续作用机制。

此外细胞焦亡还可引发心肌细胞、心脏成纤维细胞、血管内皮细胞等多种细胞死亡和炎症反应[47]，使细胞焦亡在心血管疾病中的作用备受关注[48]。高血糖促使生产过量的ROS，ROS可经NF-κB和TXNIP促进NLRP3炎症小体的激活，引发焦亡进而导致心肌细胞死亡，影响心肌细胞正常功能，甚至产生不良结局。实验研究表明，二甲双胍也可对糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)起保护作用，在体内外均可下调NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达，减轻细胞焦亡伴随的炎症对心脏的损伤[49]。T2DM大鼠经厄贝沙坦治疗后心肌细胞焦亡的经典通路激活被抑制，心肌形态和功能改善，认为与NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路激活受到影响有关[50]。西格列汀可上调心肌细胞中SIRT3表达，并抑制心肌细胞焦亡减少DCM发生[51]。此外，除NLRP3炎性小体参与DCM的病理改变外，沉默AIM2炎性小体也可抑制细胞焦亡及炎症反应减缓DCM的进展[52]。

最近研究发现在高糖诱导的大鼠施万细胞系RSC96建立的糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)细胞模型中，ROS生成，NF-κB核移位，TXNIP表达，NLRP3炎性小体被激活，NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18等细胞焦亡相关因子表达上调，诱发施万细胞焦亡损伤周围神经[53]。此外，Hong等[54]在DM加重的脑缺血损伤中，抑制NLRP3介导的细胞焦亡减轻DM小鼠的神经功能缺损，减少脑梗死体积，并提高DM小鼠脑缺血再灌注损伤后的存活率。Tu等[55]研究表明亚低温可能通过增加自噬小体而激活自噬，进而抑制细胞焦亡，从而减轻DM所致的脑缺血损伤。褪黑素可通过调节miR-214-3p/Caspase-1和miR214-3p/ATG12轴，抑制神经元细胞过度焦亡和自噬，显著减轻STZ诱导的DM小鼠经高糖处理后神经细胞的死亡[56]。

3 糖尿病及其并发症防治领域中医药与细胞焦亡研究进展

中医学“未病先防，已病防变”的“治未病”思想对于DM的防治优势显著。尤其针对现阶段国民因“多食少动”而致的T2DM高发的社会医疗现实，充分发挥中医药在该领域的优势和特长对遏制DM及并发症发生发展、提高国民生活质量、减轻家庭及社会医疗负担尤为重要。细胞焦亡虽然是新近才被发现的一种新型细胞程序性死亡形式，但有学者认为可以用中医学的“阴阳理论”对其进行“解读”[57]。如若在感染性疾病中病原体在宿主细胞中复制，为“阴”蓄积，细胞焦亡通过释放宿主细胞内含物，激发先天免疫反应，减少病原体复制，为“阳”生发，当阴阳达到平衡，可处于阳收阴藏的状态。如若体内焦亡过度或不及，可相应产生阴阳偏胜或偏衰的病理变化及病理产物，例如低水平焦亡表现出阳气不足，内生痰瘀毒邪[58]。另外有学者认为细胞焦亡过程中的炎性小体及炎症属于“毒邪”范畴，当焦亡过度，则毒邪、痰浊、瘀血产生，导致多种疾病的发生。还有学者认为因瘀血引发的血管损伤为DM多种并发症的病理基础，在细胞焦亡中炎症小体过度激活促进动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的形成，与毒邪转化为痰浊和瘀血而导致ASCVD的过程一致[59]。

实验研究发现丹参中丹酚酸A可降低T2DM大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)水平，减轻血糖波动，抑制主动脉组织中NLRP3炎症体的激活和NF-κB信号转导，其抗炎作用可减缓ZDF大鼠T2DM并发ASCVD的发展[60]。无患子皂苷在高糖诱导的H9C2心肌细胞中对细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达进行调控，抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡[61]。人参皂苷Rh2可抑制溶酶体膜透化上调cathepsin B和cathepsin L表达水平，改善溶酶体功能降低Caspase-1介导的细胞焦亡从而起到减缓DKD肾脏损伤的作用[62]。栀子中的栀子糖苷对HFD/STZ、高糖处理的DKD小鼠肾足细胞APMK/SIRT1/NF-κB通路中起抑制作用，从而减轻炎症和氧化应激对DKD的影响[63]。山茱萸中的马钱苷可通过抑制ROS的生成和抑制NLRP3炎性小体的激活预防RSC96施万细胞焦亡，有望成为减轻DM周围神经损伤的药物成分[53]。笔者所在课题组研究认为，现代人“多食少动”所致痰湿郁/瘀热状态是导致代谢类疾病高发的病理基础，分消走泄法代表方剂温胆汤、黄连温胆汤是代表方剂。新近研究结果表明，糖耐量低减(IGT)的发生发展与Caspase-1/GSDMD 介导的肝细胞焦亡以及伴随的炎症反应密切相关，黄连温胆汤通过抑制细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/GSDMD/IL-1β、IL-18经典通路降低痰湿郁热型IGT大鼠肝脏中IL-1β、IL-18的表达，减轻细胞焦亡改善 IR，逆转IGT病程[64-65]，这为中医复方在T2DM“未病先防、已病防变”的相关研究提供了新思路。另有学者研究发现，半夏厚朴汤抑制CUMS大鼠肝脏和脑部NLRP3炎性小体激活和IL-1β释放，影响胰岛素信号传导而起到改善CUMS大鼠糖耐量、抗抑郁的作用[66]。有关经方乌梅丸的研究表明该方可抑制db/db小鼠胰腺NLRP3炎性小体激活，保护胰腺β细胞减少T2DM的发生发展[67]。中药、中药成分以及复方调控细胞焦亡防治DM的研究尚处于起步阶段，相应成果较少。随着细胞焦亡与糖尿病相关机制研究的深入，中药及复方所具有的多靶点、多层次、双向调节等特点，有望被更全面、更清晰地诠释，以丰富中医药防治DM作用机制的内涵并更好地服务于临床实际。

4 小 结

经过二十余年的研究，细胞焦亡这一新型程序性细胞死亡方式的产生机制已经得到基本公认，其在与疾病产生发展的相关机制也在迅速深入并取得重大进展，但有关细胞焦亡与慢性非感染性低度炎症性疾病如DM的相关机制尚需大量工作，在该领域的深入研究将进一步促进DM的有效防治。发挥中医药学对DM防治的理论与实践的优势，利用现代技术手段，结合最新中西医研究进展，从“多食少动-湿热状态-慢性低度炎症-细胞焦亡”这一链条出发，探求中药及复方调控细胞焦亡防治DM的作用机制，将为进一步探讨潜在靶向细胞焦亡、抑制扩大炎性效应的级联反应的分子及具体机制，为中西医管理及治疗以DM为代表的严重影响国民身体健康、生活质量代谢性疾病提供新思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。