1株人3型副流感病毒减毒活疫苗候选毒株在小鼠动物模型上的安全性、免疫原性及保护效力评价

关文竹，火文，李雄雄，王云瑾，王晓，程亚慧，寇桂英，包红，白慕群

兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃 兰州 730046

人3型副流感病毒（human parainfluenza virus type-3，HPIV-3）是仅次于呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）引起5岁以下婴幼儿急性下呼吸道严重疾病的病原体，主要引起婴幼儿肺炎、支气管炎和中耳炎［1］，且与幼儿呼吸暂停有关［2］。流行病学研究显示，5岁以下婴幼儿80%感染过HPIV-3，造成了很大的疾病和经济负担。另外，HPIV-3感染还是导致老年慢性病患者和免疫力低下成年人下呼吸道疾病及死亡的重要原因［3-6］；在器官移植和免疫抑制患者中，HPIV-3感染导致的死亡率为3%～47%［7-8］。

目前尚无治疗HPIV-3感染的特效药物和预防性疫苗上市［9-10］。HPIV-3疫苗研发中，灭活疫苗由于其接种后的疾病增强作用而被放弃［11］，减毒活疫苗和亚单位疫苗是目前疫苗研发的主要目标。本研究旨在筛选具有冷适应（cold-adaptation，Ca）及温度敏感（temperature sensitivity，Ts）特性的HPIV-3毒株，并在小鼠动物模型中评价其安全性、免疫原性和保护效力，以期为HPIV-3减毒活疫苗的研发提供候选毒株。

1 材料与方法

1.1 临床标本 为甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼吸道分泌物标本。

1.2 细胞及病毒 人胚肺成纤维细胞（WI-38）和非洲绿猴肾细胞（Vero）由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室传代并保存；HPIV-3LZ1728C19（HPIV-3野毒株，滴度为8.5×108拷贝／mL，用于攻毒试验和淋巴细胞刺激抗原的制备）、HPIV-3LZ150-1W3（HPIV-3野毒株，从HPIV-3阳性临床标本克隆纯化并去除了包括支原体在内的7种外源因子，为CPW3的亲本野毒株，滴度为8.9×107拷贝／mL）和CPW3毒株（HPIV-3冷适应温度敏感株，由HPIV-3LZ1501W3高滴度克隆纯化毒株按1∶100稀释度接种于T25 Vero细胞培养瓶，并加入5-氟尿嘧啶，终浓度为10µg／mL。培养温度从35℃开始连续低温传代，降温幅度2℃，即35、33、31、29、27、25℃，每个温度培养10代。25℃时经55次传代，最终获得具有Ca和Ts特性的HPIV-3毒株CPW3，25℃时滴度为2.1×106拷贝／mL）均由该研究室分离筛选并保存。

1.3 实验动物SPF级雌性BALB／c小鼠，2周龄，体质量13.5～14.5 g，由兰州生物制品研究所有限责任公司动物室提供并饲养，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2017-0001。本实验均以科研为目的对BALB／c小鼠进行养殖和使用，且按照中华人民共和国《实验动物管理条例》进行动物实验。

1.4 主要试剂及仪器Anti-Mouse IgA antibody-HRP conjugate、Anti-Mouse IgG（H+L）antibody-HRP conjugate和去支原体抗生素Plasmocin均购自美国Invitrogen公司；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）+离子霉素（ionomycin）、Fc block（Rat Anti-Mouse CD16／CD32）、FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse CD8ɑ、APC Rat Anti-Mouse IFNγ、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse CD3、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse IL-4、蛋白转运抑制剂BFA（brefeldin A）、细胞固定／细胞破膜溶液试剂盒、Stain Buffer和AccuriTMC6流式细胞分析仪均购自美国BD公司；TrueBlueTMPeroxidase Substrate显色剂购自美国KPL公司；RNeasy mini kit试剂盒购自美国QIAGEN公司；One-Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）购自日本TaKaRa公司；细胞培养基DMEM、MEM、RPMI1640购自美国GIBCO公司；新生小牛血清购自广州赛国生物科技有限公司；HEPES缓冲液、中性红、5-氟尿嘧啶、细胞消化用胰酶和噬斑用低熔点琼脂糖均购自美国Sigma公司；兔抗重组HPIV-3 HN和F蛋白多克隆抗体为兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室制备；鼠淋巴细胞分离液购自深圳市达科为生物技术股份有限公司；7500 Real Time PCR System购自美国AB公司；Elispot／FluoroSpot Reader System购自德国AID公司。

1.5 HPIV-3 Ca和Ts毒株的筛选

1.5.1 HPIV-3阳性临床标本的筛选 取甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼吸道分泌物标本，涡旋振荡后，12 000×g离心20 min，上清液用0.22µm针式滤器除菌过滤后，接种至铺满WI-38细胞的6孔板中，37℃孵育2 h；弃上清，加入3 mL含10µg／mL支原体去除剂Plasmocin的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养7 d，孔对孔连续传代10次后进行RT-PCR检测，挑取HPIV-3阳性孔。

1.5.2 HPIV-3阳性培养物的噬斑克隆纯化 将10次连续传代培养的HPIV-3阳性培养上清液进行10倍系列稀释（10-1～10-8），各稀释度病毒分别接种至铺满WI-38细胞的6孔板中，1 mL／孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养2 h；弃上清液，加入DMEM配制的0.8%低熔点琼脂糖，3 mL／孔，室温凝固后，倒置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养4 d；加入DMEM配制的含0.015%中性红的1%低熔点琼脂糖，1 mL／孔，室温凝固后，倒置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h；在病毒高稀释度孔中挑取噬斑，接种于铺满WI-38细胞的24孔板中，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养7 d；qRT-PCR检测HPIV-3阳性克隆培养物，挑取12个HPIV-3阳性初始克隆，每个连续克隆5次，克隆所用液体中均加入10µg／mL支原体去除剂Plasmocin；最后挑选12个来源于不同HPIV-3阳性初始克隆的高滴度HPIV-3克隆毒株进行外源因子检测，12个克隆毒株分别命名为LZ1501W1～LZ1501W12。

1.5.3 HPIV-3 Ca和Ts株的筛选 采用诱变剂加逐步降温法筛选。将上述克隆纯化去除外源因子的12个LZ1501高滴度克隆纯化毒株按照1∶100分别接种至铺满WI-38细胞的T25培养瓶中，每瓶加入5-氟尿嘧啶（终浓度10µg／mL），进行传代培养，培养温度从35℃开始，降温幅度2℃，即35、33、31、29、27、25℃，每个温度传代培养10代，直至出现具有Ts特性的毒株。

1.6 Ca和Ts特性鉴定

1.6.1 CPW3病毒在细胞培养中的Ca和Ts特性鉴定 将CPW3及其亲本野毒株LZ1501W3分别接种于铺满WI-38细胞的T25细胞培养瓶中，两毒株各接种3瓶，分别置25、37和40℃培养7 d，qRT-PCR测定每瓶病毒培养液的滴度，并观察细胞病变。

1.6.2 CPW3在小鼠模型上的Ts特性鉴定 将BALB／c小鼠随机分为2组，每组21只。所有小鼠均经腹腔注射5%水合氯醛麻醉，100µL／只，待小鼠失去行动力后，一组经鼻腔接种CPW3病毒培养液2.1×106拷贝／mL，20µL／只；另一组经鼻腔接种CPW3毒株的野生亲本毒株LZ1501W3病毒培养液8.9×107拷贝／mL，20µL／只。接种后第3天，qRT-PCR检测小鼠肺组织和鼻洗液中HPIV-3滴度。

1.7 CPW3病毒Ca和Ts株的纯化及电镜观察 将CPW3病毒株以0.01 MOI接种于WI-38细胞，置于25℃，5% CO2培养箱中培养7 d，收集培养上清液，qRT-PCR检测病毒滴度，4℃保存。取病毒培养液，4℃，8 000×g离心30 min，沉淀细胞碎片，收集上清液；取50 mL上清加入70 mL专用离心管中，用8 cm长针头从底部轻轻推入20 mL 50%蔗糖（操作中注意保持界面清晰），4℃，35 000×g超速离心4 h；弃上清液，用无菌三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（TNE Buffer）重悬沉淀，测定病毒蛋白浓度，电镜观察病毒形态（由兰州大学电镜中心完成）。

1.8 CPW3病毒外壳HN和F蛋白的Western blot鉴定 将超速离心纯化的CPW3病毒蛋白经12%SDSPAGE分离后，进行Western blot分析，以兔抗重组HPIV-3 HN和F蛋白抗体为一抗。

1.9 Ca和Ts株的遗传特征分析 采用二代基因测序法对CPW3毒株全基因序列进行测定，由上海伯杰医疗科技有限公司完成。

1.10 HPIV-3减毒活疫苗候选株的制备 将CPW3病毒培养液按0.01 MOI接种WI-38细胞，置于25℃，5% CO2培养箱培养7 d，qRT-PCR测定病毒滴度为2.1×106拷贝／mL，8 000×g离心40 min，收集上清，作为疫苗备用。

1.11 动物分组及免疫 将BALB／c小鼠随机分为11组：试验组（CPW3组）9组、阳性对照组（LZ1501W 3组）1组、阴性对照组1组，每组21只，所有小鼠均经腹腔注射5%水合氯醛麻醉，100µL／只，待小鼠失去行动力。试验组均经鼻腔接种CPW3病毒培养液，20µL／只，其中1～3组接种1剂，4～6组接种2剂，7～9组接种3剂，间隔28 d；阳性对照组经鼻腔接种LZ1501W3病毒培养液（滴度8.9×107拷贝／mL），与试验组分开饲养，只接种1剂；阴性对照组经鼻腔接种20µL DMEM液体培养基，与试验组分开饲养，不做任何处理。

1.12 免疫小鼠体温及体质量检测 每天监测各组小鼠体温及体质量。

1.13 免疫小鼠对HPIV-3感染的保护效力检测 分别在2剂和3剂CPW3接种后第40天用HPIV-3野毒株HPIV-3LZ1728C19经鼻腔进行攻毒，攻毒后第3天，采用qRT-PCR法检测小鼠肺中病毒载量。分别选取CPW3 3剂免疫后3 d及攻毒后3 d，亲本株LZ1-501W3及野毒株HPIV-3LZ1728C19感染后3 d的小鼠肺，做病理切片。

1.14 HPIV-3减毒活疫苗候选株免疫原性检测

1.14.1 小鼠上、下呼吸道CPW3病毒载量的检测 每剂接种后第3天，取小鼠鼻腔灌洗液和肺组织，采用qRT-PCR方法检测CPW3病毒载量。用RNeasy mini kit试剂盒提取小鼠鼻腔灌洗液和肺组织RNA，将纯化的病毒RNA置0℃冰浴备用。用One-Step Prime-ScriptTMRT-PCR Kit完成qRT-PCR，引物（realHNS／realHNA）和探针HNprobe序列均位于HPIV-3的HN基因上，序列未公布。用4.7～4.7×107拷贝／mL体外转录HNRNA建立标准曲线。反应体系：2×one step RTPCR bufferⅢ10µL，TaKaRa Ex TaqHS 0.4µL，Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4µL，realHNS（10 pmol／µL）0.6µL，realHNA（10 pmol／µL）0.6µL，HNProbe（10 pmol／µL）0.2µL，50×ROX参比染料0.4µL，RNA模板2µL，RNase free H2O 5.4µL。扩增程序：42℃5 min，95℃10 s；95℃5 s，57℃34 s，40个循环。

1.14.2 体液免疫应答检测

1.14.2.1 小鼠血清HPIV-3特异性中和抗体检测 采用噬斑减少试验检测CPW3 2剂和3剂免疫小鼠后第40天，小鼠血清HPIV-3特异性中和抗体滴度。

HPIV-3 LZ1728C19病毒工作稀释度确定：病毒5倍系列稀释后，接种于铺满Vero细胞的24孔板，37℃，5% CO2条件下培养2 h；弃上清液，加入MEM配置的1%低熔点琼脂糖1 mL，室温凝固后，倒置于37℃，5% CO2培养箱培养6 d；加入MEM配置的含0.015%中性红的1%低熔点琼脂糖1 mL，室温凝固后，置于37℃，5%CO2培养箱，次日观察出斑，以80%细胞出现噬斑的病毒稀释度作为病毒的工作稀释度。

血清特异性中和抗体测定：CPW3阳性血清2倍系列稀释后，与等体积工作稀释度的HPIV-3 LZ1728-C19病毒混合，37℃下结合2 h；将结合的血清-病毒液分别接种于铺满Vero细胞的24孔板，后续方法与上述相同。空白对照血清稀释液与等体积工作稀释度的HPIV-3 LZ1728C19病毒混合，37℃下结合2 h后，接种于Vero细胞作为mock对照。与mock对照的噬斑数相比，能使噬斑数降低50%的血清稀释度为血清中和抗体滴度。

1.14.2.2 小鼠HPIV-3特异性IgA、IgG抗体分泌淋巴细胞（antibody secreting cells，ASC）的免疫应答检测 为了研究CPW3免疫后小鼠组织定植ASC的免疫应答，分别于不同剂次免疫后第3天（post innoculation day 3，PID3）、免疫后第40天（post inoculation day 40，PID40）攻毒前及免疫后第43天（post inoculation day 43，PID43）／攻毒后第3天（post challenge day 3，PCD3），提取小鼠肺、脾和外周血淋巴细胞，检测HPIV-3特异性ASC应答。

1.14.2.2.1 淋巴细胞分离 外周血：每7只小鼠眼球采血3.5 mL左右，滴入10 mL 37℃预热枸橼酸抗凝剂中，混匀后加入13.5 mL 37℃预热的RPMI1640培养基并混匀，采用反推法缓慢在底部推入13.5 mL淋巴细胞分离液；脾、肺：无菌取小鼠脾和肺，在200目研磨网上用小鼠淋巴细胞分离液研磨，每7只小鼠的肺或脾脏研磨液分别放入15 mL离心管，用淋巴细胞分离液定容至10 mL，在离心管上端覆盖1.5 mL RPMI1640培养液。上述溶液4℃，800×g离心20 min后吸出淋巴细胞层，加入10 mL RPMI1640培养基洗涤、离心，用无血清RPMI1640培养基重悬细胞后计数，37℃保温备用。

1.14.2.2.2 HPIV-3特异性ASC应答检测 采用酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot assay，ELIspot）。将浓度为5×105个／mL的MA104细胞加入96孔细胞培养板中，200µL／孔，37℃培养72 h；用1∶2 000稀释的HPIV-3LZ1728C19病毒培养液感染细胞，37℃培养72 h后用80%丙酮固定，-20℃保存备用。将脾、肺、外周血中提取的淋巴细胞分别稀释为5×106、5×105、5×104个／mL，加入制备的96孔板中，每个浓度均设复孔，500×g离心5 min，37℃，5%CO2条件下孵育12 h；用PBST（PBS-tween 20）缓冲液洗板6次，分别加入抗鼠IgA和IgG抗体，50µL／孔，37℃，5% CO2条件下孵育2 h；用PBST缓冲液洗板6次，加入TrueBlueTMPeroxidase Substrate显色剂，50µL／孔，37℃，5%CO2条件下孵育2 h；ELIspot／FluoroSpot Reader System读取每孔蓝色斑点数。

1.14.3 细胞免疫应答检测 采用流式细胞术测定在PID3、PID40以及PCD3，小鼠肺、脾和外周血淋巴细胞中HPIV-3特异性IFNγ-CD4+T、IFNγ-CD8+T细胞应答。使用野毒株HPIV-3LZ1728C19制备刺激抗原，抗原的制备和纯化方法同1.7项。淋巴细胞刺激及染色：将1.14.2.2.1项分离的淋巴细胞稀释至1×107个／mL，加入V底96孔板中，100µL／孔，试验组每孔加入12µg淋巴细胞刺激用抗原，37℃，5%CO2条件下孵育14 h；每孔加入1µL BFA，继续孵育至17 h，离心收集细胞。同时设阴性对照（不使用抗原刺激）和阳性对照（加入PMA+离子霉素以及BFA），37℃，5%CO2条件下孵育6 h，离心收集细胞。用抗小鼠CD4、CD8ɑ、CD3、IFNγ、IL-4抗体分别染色，进行流式细胞术分析。分别设置CD3、CD8、CD4、IFNγ、IL-4单染色对照管，用于调节补偿。

另采用流式细胞术检测攻毒后小鼠外周血中IFNγ-CD4+T和IL-4-CD4+T淋巴细胞的应答，分析CPW3免疫诱导的小鼠Th细胞应答类型。

1.15 统计学分析 应用Graphpad prism 7.0软件，采用Unpaired t test with Welch's correction方法进行差异分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPIV-3 Ca和Ts株的筛选 在35～27℃的50代Ca传代培养过程中，病毒的平均滴度下降了1 lg；继续在25℃传35代，所有克隆培养孔病毒滴度均下降，最高下降4 lg；继续传代，随着25℃传代次数的增加，有2个克隆株的滴度经过降低之后缓慢升高，最终在25℃传30代后，病毒滴度达106拷贝／mL，将其中1个毒株命名为CPW3，将CPW3的亲本野毒株命名为LZ1501W3。见图1。

图1 HPIV-3 Ca和Ts株的筛选Fig.1 Screening of HPIV-3 strain with Ca and Ts

2.2 Ca和Ts特性鉴定

2.2.1 CPW3在细胞培养中的Ca和Ts特性 显微镜下观察可见，CPW3在25℃培养至第7天，WI-38细胞出现挛缩、变短变圆，大量死亡脱落并悬浮在病毒培养液中，该细胞病变明显强于CPW3在37和40℃培养条件下的细胞病变，而LZ1501W3在37℃培养条件下所致WI-38细胞病变最为显著，见图2。

与LZ1501W3相比，CPW3在25℃培养的病毒滴度提高了3.59 lg（t=28.38，P＜0.000 1），表明CPW3具有了Ca的特点；在40℃培养的病毒滴度降低了4.86 lg（t=59.62，P＜0.000 1），在37℃培养的病毒滴度下降了2.55 lg（t=32.49，P＜0.000 1），表明CPW3在细胞培养中具有了Ts的特性。见图3。

2.2.2 CPW3在小鼠模型上的Ts特性CPW3和LZ-1501W3在小鼠肺组织的病毒载量分别为5.58和7.67 lg，在小鼠鼻腔洗液中的病毒载量分别为4.78和4.27 lg。与LZ1501W3相比，CPW3在小鼠肺组织的病毒载量显著下降了2.09 lg（t=7.346，P＜0.000 1），在小鼠鼻腔洗液中的病毒载量显著增加了0.51 lg（t=2.62，P＜0.01）。见图4。表明CPW3在小鼠的上下呼吸道也具有Ts特性。

图2 CPW3及其亲本野毒株LZ1501W3在不同培养温度下的致细胞病变观察（×100）Fig.2 Microscopy of CPE caused by CPW3 and its parent wild strain LZ1501W3 cultured at various temperatures（×100）

图3 CPW3及其亲本野毒株LZ1501W3在不同培养温度下的滴度Fig.3 Titers of CPW3 and its parent wild strain LZ1501W3 cultured at various temperatures

图4 CPW3及其亲本野毒株LZ1501W3在小鼠鼻腔洗液（A）和肺组织（B）的病毒载量Fig.4 Virus loads of CPW3 and its parent wild strain LZ15-01W3 in nasal washes（A）and lung tissues（B）of mice

2.3 CPW3病毒Ca和Ts株的电镜观察 纯化的CPW3病毒在电镜下可观察到150 nm左右的病毒颗粒，且在病毒外周可见清晰的脂质外膜，见图5。

2.4 CPW3病毒外壳HN和F蛋白的Western blot鉴定 超速离心纯化的CPW3病毒与兔抗重组HPIV-3 HN蛋白抗体在预期相对分子质量约64 000处出现特异性反应条带，与兔抗重组F蛋白抗体在预期相对分子质量约60 000处出现较弱的F0条带，同时在相对分子质量约50 000处也出现更强的反应条带，与F0蛋白的Furin酶切产物F1的大小一致，见图6。表明CPW3毒株具有HPIV-3的HN和F蛋白。

图5 纯化CPW3病毒的电镜观察Fig.5 Electron microscopy of purified CPW3 virus

图6 纯化CPW3病毒的Western blot鉴定Fig.6 Western blotting of purified CPW3 virus

2.5 Ca和Ts株的遗传特征分析 测序结果表明，CPW3毒株的全基因序列含15 404个核苷酸，通过核苷酸序列分析可知，CPW3与GenBank上HPIV-3分离株HPIV3／UK／ref／MK9（登录号：MH678682.1）的同源性为99.84%。进化树分析显示，CPW3处于单独的进化分支，且位于进化分支的上游，见图7。核苷酸序列分析可知，CPW3株基因核苷酸序列符合副黏病毒科基因组“6碱基原则”，按照5'-NP（111-1 658）-PP／C（1 784-3 592）-M（3 753-4 814）-F（5 072-6 691）-HN（6 806-8 524）-L（8 571-15 347）-3'的顺序编码6种蛋白，基因结构与已知序列HPIV-3分离株相同。表明CPW3毒株是PIV-3。与亲本野毒株LZ501W3比较发现，CPW3共存在17个核苷酸突变位点，见表1。其中NP基因上有2个，PP基因上有1个，M基因上有2个，F基因上有4个，HN基因上有2个，L基因上有6个。其中12个位于NP、PP、M、F、L基因中的核苷酸突变导致编码氨基酸发生替换，见表2。

图7 CPW3全基因组遗传进化分析Fig.7 Genetic evolution analysis of whole genome of CPW3

表1 CPW3基因突变位点Tab.1 Gene mutation sites in CPW3

表2 CPW3氨基酸变化Tab.2 Amino acid changes of CPW3

2.6 CPW3对小鼠体温及体质量的影响 感染后30 d内，小鼠体温均在正常范围内波动，第9组试验组和阳性对照组与阴性对照组相比，差异均无统计学意义（t分 别为1.022和1.786，P分 别 为0.315 6和0.085 3）。感染后30 d内，试验组小鼠体质量的增加与阴性对照组相比，差异无统计学意义（t=1.909，P＞0.05）；而阳性对照组体重增加从感染后第3天开始显著滞后于阴性对照组（t=8.558，P＜0.000 1），随后体重差异逐渐缩小，直至感染后24 d达到一致，该现象与HPIV-3野毒株在小鼠肺内病毒清除相关。见图8。而且CPW3免疫后，所有小鼠均未出现腹泻、体态和精神异常以及死亡的情况。

图8 CPW3免疫后小鼠的体温（A）和体质量（B）Fig.8 Body temperature（A）and body mass（B）of mice immunized with CPW3

2.7 CPW3免疫小鼠对HPIV-3感染的保护效力qRTPCR检测结果显示，CPW3免疫对小鼠肺部HPIV-3感染具有显著性保护效力，与对照组相比，2剂接种后，小鼠肺部病毒载量降低了0.81 lg（t=2.653，P=0.011 4）；3剂免疫后，小鼠肺部病毒载量降低了1.85 lg（t=2.836，P=0.007 1）。见图9。

病理切片观察显示，与正常小鼠相比，CPW3亲本株LZ1501W3感染小鼠肺部炎症病变较为明显，包括肺组织血管扩张充血，肺泡壁增宽，支气管黏膜上皮细胞坏死脱落，肺泡腔及支气管内出现以红细胞、少量巨噬细胞、淋巴细胞和纤维素渗出为主的慢性炎细胞浸润等病理反应；而CPW3免疫小鼠其肺泡间隔清晰，肺泡腔可见少量浆液和纤维素渗出，且攻毒后，小鼠肺组织结构完整，未出现相关严重的病理反应。见图10。

图9 CPW3免疫对小鼠下呼吸道HPIV-3感染的保护效力Fig.9 Protective efficacy of CPW3 immunization against HPIV-3 infection in lower respiratory tract of mice

图10 小鼠肺部病理变化（HE染色）Fig.10 Pathological changes in lung tissue of mice（HE staining）

2.8 HPIV-3减毒活疫苗候选株的免疫原性

2.8.1 CPW3在小鼠上、下呼吸道的增殖 每剂接种后，CPW3均可在小鼠上、下呼吸道显著增殖，与阴性对照组相比，1剂免疫后第3天，CPW3在小鼠肺组织的病毒载量提高了2.7 lg（t=6.993，P＜0.000 1），在鼻腔的病毒载量提高了3.1 lg（t=6.132，P＜0.000 1）；与1剂免疫后第3天相比，第3剂免疫后第3天，CPW3在小鼠肺组织的病毒载量降低了0.5 lg（t=5.324，P＜0.000 1），而在鼻腔中，每剂接种均可导致病毒载量逐渐降低，且差异均有统计学意义（t分别为5.502和5.624，P均＜0.000 1）。见图11。

图11 CPW3在小鼠鼻腔（A）和肺组织（B）的增殖Fig.11 Proliferation of CPW3 in nasal cavity（A）and lung tissue（B）of mice

2.8.2 体液免疫应答

2.8.2.1 CPW3免疫小鼠血清HPIV-3特异性中和抗体应答CPW3免疫可诱导小鼠显著的血清HPIV-3特异性中和抗体应答，且具有剂次效应，与阴性对照组相比，2剂接种后小鼠中和抗体几何平均滴度升高了120倍（t=9.784，P＜0.000 1），3剂免疫后则提高了1 387倍（t=7.296，P＜0.000 1）。见图12。

2.8.2.2 CPW3免疫小鼠HPIV-3特异性IgA、IgG ASC的免疫应答ELIspot法检测结果表明，在肺部，CPW3免疫不仅能够显著诱导免疫后反应性（PID3）IgA（t=3.296，P=0.007 6）和IgG（t=2.884，P=0.0215）ASC应答，还可诱导显著的攻毒后记忆性（PCD3）IgA（2剂攻毒：t=2.396，P=0.036；3剂攻毒：t=10.76，P＜0.000 1）和IgG（2剂攻毒：t=4.772，P=0.000 76；3剂攻毒：t=6.45，P＜0.000 1）ASC免疫应答；在脾脏中，CPW3只诱导免疫后显著反应性（PID3）（t=6.311，P＜0.000 1）和攻毒后的记忆性（PCD3）IgG ASC免疫应答（2剂攻毒：t=5.067，P＜0.001；3剂攻毒：t=2.733，P＜0.05）；在外周血中则均无显著应答。而且免疫后无论是反应性还是记忆性免疫应答，IgG ASC在脾脏中的应答均高于肺脏。见图13和图14。

2.8.3 细胞免疫应答 流式细胞术检测结果显示，在PID3，CPW3可显著诱导小鼠肺（t=4.114，P=0.004 3）、脾（t=6.258，P=0.002 2）和外周血（t=2.241，P=0.044 7）中定植反应性IFNγ-CD8+T细胞的应答，且具有剂次效应；而且，肺和脾中IFNγ-CD8+T细胞的应答高于外周血，而反应性IFNγ-CD4+T细胞应答在3种组织中均无显著增加。见图15。攻毒试验显示，在PCD3，CPW3免疫可显著诱导小鼠肺（1剂攻毒：t=3.58，P=0.001 5；2剂攻毒：t=4.62，P=0.000 1；3剂攻毒：t=4.005，P=0.000 5）、脾（2剂攻毒：t=7.024，P=0.002 2；3剂攻毒：t=3.879，P=0.018）和外周血（2剂攻毒：t=3.75，P=0.02；3剂攻毒：t=8.309，P＜0.001）中记忆性IFNγ-CD8+T细胞的应答，且具有剂次效应；同时还可诱导肺（2剂攻毒：t=2.927，P=0.043；3剂攻毒：t=4.941，P=0.038）、脾（3剂攻毒：t=6.589，P=0.002 7）和外周血（2剂攻毒：t=3.618，P=0.02；3剂攻毒：t=4.594，P＜0.01）中记忆性IFNγ-CD4+T细胞显著应答，也具有剂次效应。见图16。

CPW3可诱导Th1／Th2混合型但稍偏向于Th1的免疫应答，见图17。

图12 CPW3免疫诱导的小鼠血清中和抗体应答Fig.12 Serum neutralizing antibody response in mice immunized with CPW3

图13 CPW3免疫诱导的小鼠反应性HPIV-3特异性IgA、IgG ASC免疫应答Fig.13 HPIV-3 specific reactive IgA and IgG ASC responses in mice immunized with CPW3

图14 CPW3免疫诱导的小鼠记忆性HPIV-3特异性IgA、IgG ASC免疫应答Fig.14 HPIV-3 specific memory IgG and IgA ASC responses in mice immunized with CPW3

图15 CPW3免疫诱导的小鼠反应性HPIV-3特异性T细胞免疫应答Fig.15 HPIV-3 specific reactive T cell response in mice immunized with CPW3

图16 CPW3免疫诱导的小鼠记忆性HPIV-3特异性T细胞免疫应答Fig.16 HPIV-3 specific memory T cell response in mice immunized with CPW3

图17 CPW3免疫诱导的小鼠免疫应答类型Fig.17Immune response types in mice immunized withCPW3

3 讨论

HPIV-3是引起3岁以内婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，HPIV-3疫苗的研制对婴幼儿下呼吸道感染疾病的预防具有重要意义。在HPIV-3疫苗研发中，灭活疫苗由于存在免疫接种后的疾病增强作用［11-13］，已被放弃。由于新生儿的免疫系统发育不成熟，免疫功能还不够完善，不能引起足够有效的免疫应答和保护效力，亚单位疫苗的目标人群主要是老年人以及孕妇。孕妇接种亚单位疫苗，可通过母传抗体对新生儿进行保护［14-15］。对于婴幼儿，鼻腔黏膜接种HPIV-3减毒活疫苗是最佳选择［2，13，16-17］。首先，鼻内接种简单方便；其次，经黏膜免疫，疫苗可在呼吸道上皮细胞中复制，诱导MHC-Ⅰ型免疫应答，不仅诱导呼吸道局部黏膜抗体分泌B细胞免疫应答，还可诱导具有CTL功能的黏膜CD8+T细胞免疫应答，将病毒从感染细胞中清除；最后，经鼻腔接种后，疫苗在婴儿中的复制不受被动获得的病毒特异性母体抗体的限制［18］。目前，有两种HPIV-3减毒活疫苗进入临床研究，一个是基于异源相关病毒的交叉保护，牛3型副流感病毒（bovin parainfluenza virus type-3，BPIV-3）被认为是一个有希望的候选疫苗［19］，二期临床结果显示，BPIV-3减毒活疫苗在婴儿中具有很好的安全性和耐受性，而且可诱导BPIV-3血清抗体应答，并对HPIV-3感染具有交叉保护效力；另一个疫苗候选株是由HPIV-3经Ca传代得到的具有Ts特性的HPIV-3减毒株CP45，研究显示，CP45比BPIV-3具有更强的免疫原性［20-21］，二期临床结果表明，在血清HPIV-3抗体阴性婴幼儿中，CP45具有很好的安全性和耐受性，且能诱导较高的中和抗体应答和保护效力。因此，HPIV-3 Ca和Ts减毒疫苗的研发对婴幼儿HPIV-3感染的保护具有重要意义。

本研究将从临床标本分离纯化的高滴度病毒株LZ1501以化学诱变及连续降温传代的方法进行Ca培养，筛选出两株具有Ca和Ts特性的HPIV-3毒株CPW3、CPW5。动物实验结果显示，CPW5免疫接种可导致小鼠体质量增加显著滞后于正常小鼠，提示该病毒株存在安全性问题，因此在本文不做讨论（未发表）。与亲本野毒株LZ1501W3相比，CPW3在25℃时所致细胞病变明显强于37和40℃，且25℃时CPW3滴度显著高于其亲本野毒株LZ1501W3，而在37和40℃时，其滴度显著低于亲本野毒株；小鼠模型验证可见，CPW3在小鼠较温暖的肺部环境比在较凉的鼻环境复制更受限制，表明CPW3具有了Ca和Ts的特性。通过连续30 d的观察，与亲本株野毒株相比，在CPW3感染期间，小鼠并未出现包括体重增长迟缓、发热、腹泻、体态和精神异常及死亡的临床体征，肺部病理观察结果表明，CPW3免疫小鼠及3剂免疫后攻毒小鼠肺部结构完整，未出现与亲本株及野毒株感染小鼠后相同的炎症性病理特征，包括支气管黏膜上皮细胞坏死脱落，肺泡腔及支气管内出现以红细胞、少量巨噬细胞、淋巴细胞和纤维素渗出为主的慢性炎细胞浸润等病理反应，表明CPW3毒株的安全性良好。

核苷酸测序结果表明，CPW3的全基因序列含15 404个核苷酸，与GenBank中HPIV-3分离株HPIV3／UK／ref／MK9（登录号：MH678682.1）的同源性为99.84%。与亲本野毒株LZ501W3核苷酸序列比对发现，在N、PP、M、F、HN、L基因上共有17个突变位点，其中12个突变导致氨基酸发生替换，氨基酸的替换是否与Ts和减毒特性相关，还需进一步的实验研究。另外，CPW3与GenBank上HPIV-3减毒株CP45（登录号：U51116.1）的同源性为96.08%，通过核苷酸及氨基酸比对发现，CPW3与CP45中氨基酸突变有所不同，可在今后的研究中对两者减毒特性与氨基酸突变的相关性进行分析。

以往对婴幼儿接种减毒活疫苗研究表明，可能需接种1剂以上才能诱导机体产生有效的免疫应答［2］，因此，本研究结合文献报道和之前的研究结果（未发表）制定了间隔28 d接种3剂的免疫程序，并在2剂、3剂接种后第40天进行攻毒，通过检测上下呼吸道攻毒毒株病毒载量来研究CPW3的保护效力。通过对CPW3每剂接种后3 d在上、下呼吸道增殖情况的研究发现，随着剂次的增加，CPW3在小鼠上、下呼吸道增殖能力逐渐下降，表明前一剂免疫所产生的应答在一定程度上抑制了CPW3在小鼠体内的增殖。选取CPW3接种后40 d攻毒的原因是此时CPW3在上、下呼吸道的病毒载量已下降到低值（未发表）。结果显示，与对照组相比，接种2剂和3剂CPW3后攻毒，小鼠肺部病毒载量均显著下降，且有剂次效应。

中和抗体是疫苗保护效力和疫苗成功的关键指标［22］。对CPW3免疫后小鼠血清HPIV-3特异性中和抗体的应答研究显示，鼻腔接种3剂可诱导小鼠产生显著的血清中和抗体应答。中和抗体可与病毒结合，抑制病毒对宿主细胞的黏附和侵入，是免疫保护的重要成分［22］。而且呼吸道黏膜由单层柱状细胞构成，属于Ⅰ型黏膜上皮，血液中的中和抗体无论是IgA还是IgG，均可跨黏膜转运至呼吸道内腔，阻止病毒对呼吸道上皮细胞的侵染［23］。

许多研究证明，体液免疫应答不仅存在于循环系统中，而且在黏膜组织存在局部定植的抗体分泌B淋巴细胞（ASC）［24-27］，这种ASC对呼吸道、消化道以及生殖道病毒感染的保护作用至关重要［17］。对HIV的疫苗研究显示［28］，含有virosome的gp41艾滋病疫苗经鼻腔免疫非人灵长类动物，不仅可诱导循环抗体应答，还可诱导生殖道黏膜局部定植ASC应答，对HIV感染具有良好的保护作用，但肌肉注射的gp41疫苗对HIV感染的保护效力则远低于前者，原因是肌肉注射只产生循环抗体应答，而无黏膜局部定植ASC应答。本实验结果显示，CPW3减毒活疫苗鼻内3剂免疫，可显著诱导小鼠肺部局部记忆性IgA和IgG ASC的免疫应答，且具有剂次效应。这种局部定植的记忆性ASC应答可为HPIV-3感染提供长期的保护［29］。

研究显示［30-31］，与流感裂解疫苗相比，流感减毒活疫苗具有明显的优势，其不仅可诱导呼吸道局部黏膜抗体应答的产生，同时可诱导黏膜T细胞免疫应答，两者协同，在呼吸道局部发挥更强的保护作用。本实验中，接种后T细胞免疫应答研究结果显示，CPW3不仅可诱导小鼠外周血中记忆性IFNγ-CD4+T和IFNγ-CD8+T淋巴细胞应答，还可诱导显著的肺部定植记忆性IFNγ-CD8+T和IFNγ-CD4+T淋巴细胞应答，前者发挥CTL的功能，可清除细胞内感染病毒［30-33］，后者发挥Th细胞功能，调节肺部特异性抗体和细胞因子的分泌，与肺部定殖的IgG／IgA ASC共同作用，对HPIV-3感染提供保护［34］。

由于HPIV-3的感染主要存在于婴幼儿，该类人群主要特点是免疫系统发育不够完全，免疫应答偏向于Th2型，过量的Th2免疫应答可造成疾病增强效应，导致肺部炎症的增加［35-36］。因此，有效的疫苗不仅要能够诱导强烈的系统和黏膜免疫应答，以保护上、下呼吸道感染，更重要的是能够诱导Th1型免疫应答，通过产生IFNγ以及TNF和IL-2，发挥抗病毒作用。本研究中CPW3免疫可诱导小鼠肺、脾、外周血中记忆性IL-4-CD4+T细胞的显著应答，但应答水平均低于IFNγ-CD4+T细胞应答，表明CPW3免疫可诱导小鼠产生Th1和Th2混合型CD4+T免疫应答，但稍偏向于Th1型，不会引起疾病增强作用［37-40］。

综上所述，本研究筛选出的1株具有Ca和Ts特性的HPIV-3病毒株CPW3，鼻腔免疫接种小鼠显示，CPW3对小鼠体重增加和体温无显著影响，具有安全性；CPW3可显著诱导小鼠产生HPIV-3特异性肺部定植体液和细胞免疫应答，以及血清中和抗体应答，具有良好的免疫原性；攻毒试验结果表明，间隔28 d 3剂免疫CPW3，对小鼠肺部HPIV-3感染具有显著的保护效力。CPW3是一株有希望的HPIV-3减毒活疫苗候选株，值得开展进一步的研究。