不同解离液及解离条件下新型冠状病毒灭活疫苗中铝佐剂的解离效果

施金荣，申瑷琳，邓涛，潘俊杰，刘青，程小玲，罗敏，段凯

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉 430207

新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的呼吸道传染病，严重影响公共健康、经济发展和社会稳定，接种疫苗是预防控制COVID-19的有效措施之一。灭活疫苗具有生产工艺成熟、安全性良好、免疫原性稳定等优点，目前，已有多款新型冠状病毒灭活疫苗获得紧急使用或批准附条件上市［1］。国家药品监督管理局于2021年2月25日批准武汉生物制品研究所有限责任公司（简称武汉生物）生产的新型冠状病毒灭活疫苗附条件上市申请。该疫苗系将SARS-CoV-2接种于Vero细胞，收集上清液，经β-丙内酯灭活后进行澄清、超滤，再经第2次β-丙内酯灭活、凝胶层析、离子交换层析、除菌过滤后，吸附铝佐剂制备而成［2-3］。铝佐剂是应用于人类疫苗最广泛的佐剂，具有良好的安全性和有效性［4-6］，可显著提高疫苗的免疫原性，但其形成的佐剂-抗原复合物可导致大多数抗原表位隐藏于铝佐剂颗粒沉淀中，致使无法直接采用ELISA法检测抗原含量［7-8］。

国家药品监督管理局药品审评中心针对新型冠状病毒灭活疫苗发布的最新技术指导原则提出，该灭活疫苗需要进行体外效价检测，一般是检测疫苗抗原含量［9］，此项指标对新型冠状病毒灭活疫苗的产量和质量具有重要意义。目前已上市的新型冠状病毒灭活疫苗均使用了铝佐剂［1-2，10-13］，检测抗原含量过程中需加入解离液，将抗原从铝佐剂中解离下来，从而准确定量检测抗原含量。本实验对新型冠状病毒灭活疫苗的解离液及解离条件进行优化，并按《中国药典》四部（2020版）［14］规定进行验证，以期为该灭活疫苗的质量控制提供可靠的检测方法。

1 材料与方法

1.1 疫苗及疫苗参考品 新型冠状病毒灭活疫苗成品（已吸附氢氧化铝佐剂，批号：202106110A、2021-06110A、202106111A、202106201、202106202）、新型冠状病毒灭活疫苗原液（未吸附氢氧化铝佐剂，批号：202105Y097）及新型冠状病毒灭活疫苗参考品（已吸附氢氧化铝佐剂，理论抗原含量为400 WU／mL，批号：202101001）均由武汉生物提供。

1.2 主要试剂SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒由武汉生物提供；EDTA（货号：10009617）、二乙醇胺（货号：20210413）、柠檬酸钠（货号：39476466）及尿素（货号：A12360）均购自国药集团化学试剂有限公司；TritonX-100（货号：BB16BA0001）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tween20（货号：WXBD4332V）购自美国SIGMA-ALORICH公司。

1.3 解离液配制 采用纯化水配制6种解离液。解离液1：0.05 mol／L EDTA；解离液2：0.3%（v／v）二乙醇胺、1%（v／v）TritonX-100、10%（m／v）柠檬酸钠、1 mol／L尿素、0.1 mol／L EDTA，定容至100 mL；解离液3：0.3%（v／v）二乙醇胺、1%（v／v）TritonX-100、10%（m／v）柠檬酸钠、1 mol／L尿素、0.05 mol／L EDTA，定容至100 mL；解离液4：0.1 mol／L EDTA；解离液5：0.1%（v／v）TritonX-100、0.1 mol／L EDTA、0.05%（v／v）Tween20，定容至100 mL；解离液6：0.1mol／LEDTA、0.05%（v／v）Tween20，定容至100mL。

1.4 解离液的优化 以新型冠状病毒灭活疫苗成品（批号：202106110A）作为供试品，与6种解离液分别按1∶1或1∶2的体积比混合，振荡混匀，于37℃解离20 h，以新型冠状病毒灭活疫苗参考品作为对照。采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测抗原含量，并按下式计算解离率。

1.5 解离条件的优化 以新型冠状病毒灭活疫苗成品（批号：202106110A）为供试品，用最佳解离液按1∶1的体积比混合，于室温或37℃分别解离2、10和20 h，每个样品设2个复孔，经纯化水进行2倍系列稀释（1∶1～1∶128），采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测A450。

1.6 最佳解离液及解离条件的验证

1.6.1 干扰试验 以未吸附铝佐剂的新型冠状病毒灭活疫苗原液作为供试品，经纯化水稀释10倍，用最佳解离液进行2倍稀释；将未吸附铝佐剂的新型冠状病毒灭活疫苗原液用纯化水进行20倍稀释，以其作为对照。最佳条件解离后，采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测抗原含量，试验重复5次。

1.6.2 准确性 将新型冠状病毒灭活疫苗参考品用纯化水稀释至320 WU／mL，与最佳解离液按1∶1的体积比混合，最佳条件解离后，采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测抗原含量，并按下式计算回收率。试验重复6次。

1.6.3 精密性

1.6.3.1 重复性 以新型冠状病毒灭活疫苗成品（批号：202106110A）为供试品，新型冠状病毒灭活疫苗参考品作为对照，分别与最佳解离液按1∶1的体积比混合，经最佳条件解离后，采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测体外相对效力。由同一实验员于3个不同日期（2022-02-05、2022-02-06、2022-02-07）重复6次试验，计算变异系数（CV）。

1.6.3.2 中间精密性 由3名实验员（A、B、C）于同一时间按1.6.3.1项方法检测新型冠状病毒灭活疫苗成品（批号：202106110A）的体外相对效力，计算CV。

1.6.4 耐用性 以新型冠状病毒灭活疫苗成品（批号：202106110A）为供试品，新型冠状病毒灭活疫苗参考品作为对照，分别与最佳解离液按1∶1的体积比混合，于37℃解离16、20、24 h，采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测体外相对效力，并计算CV；另将供试品与最佳解离液按体积比1∶1混合，37℃解离20 h，在SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测体外相对效力过程中，加入TMB显色液终止反应，放置0、10、20 min，再用酶标仪检测，计算CV。试验均重复3次。

1.6.5 适用性 以4批新型冠状病毒灭活疫苗成品（批号：202106110A、202106111A、202106201、2021-06202）为供试品，新型冠状病毒灭活疫苗参考品为对照，分别与最佳解离液按1∶1的体积比混合，经最佳条件解离后，采用SARA-CoV-2抗原ELISA检测试剂盒检测体外相对效力，试验重复6次，计算CV。

1.7 统计学分析 应用SPSS V21.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 最佳解离液6种解离液中，解离液5的解离率最高，达70%以上；供试品与解离液体积比为1∶1时的解离效果更好。见表1。因此确定最佳解离液为解离液5，最佳体积比为1∶1。

2.2 最佳解离条件 于室温解离的供试品A450均低于37℃，其中37℃解离20 h时，不同稀释倍数的供试品A450最高，解离效果最好，见图1。因此确定37℃解离20 h作为最佳解离条件。

2.3 最佳解离液及解离条件的验证

2.3.1 干扰试验 供试品及对照品的抗原含量均值分别为7 114和7 226 WU／mL，两者差异无统计学意义（t=0.963，P＞0.05）。表明解离液5对疫苗抗原含量检测不存在干扰。

2.3.2 准确性 重复检测6次新型冠状病毒灭活疫苗参考品的抗原含量分别为321、314、320、327、322、318 WU／mL，回收率在98.13%～100.63%之间，见表2。表明该方法具有良好的准确性。

图1 不同解离条件的解离效果Fig.1 Dissociation results under various dissociation conditions

表1 不同解离液的解离效果Tab.1 Dissociation effects of various dissociation buffers

表2 准确性验证结果Tab.2 Verification for accuracy

2.3.3 精密性

2.3.3.1 重复性 同一实验员于3个不同日期（2022-02-05、2022-02-06、2022-02-07）重复检测6次供试品的体外相对效力均值分别为（0.95±0.02）、（0.97±0.06）、（0.94±0.03），CV分别为2.08%、6.12%、3.32%，均＜10%，见表3。表明该方法具有良好的重复性。

2.3.3.2 中间精密性3名实验员（A、B、C）重复检测6次供试品的体外相对效力均值分别为（0.95±0.02）、（0.94±0.03）、（0.95±0.02），CV分别为2.08%、6.12%和3.32%，均＜10%，见表4。表明该方法具有良好的中间精密性。

2.3.4 耐用性 供试品解离16、20、24 h重复3次检测体外相对效力的均值分别为（0.97±0.04）、（0.95±0.03）、（0.97±0.03），CV分别为3.72%、2.64%、3.57%，均＜10%，见表5。表明适当延长或缩短解离时间不影响检测结果。ELISA检测过程中终止反应后放置0、10、20 min的供试品，重复检测3次体外相对效力的均值分别为（0.93±0.01）、（0.94±0.00）、（0.92±0.01），CV分别为0.62%、0.00%、0.63%，均＜1%，见表6。表明适当延长或缩短终止反应后放置时间不会影响检测结果。

2.3.5 适用性 批号为202106110A、202106111A、202106201、202106202的4批供试品，重复6次检测体外相对效力的均值分别为（0.94±0.06）、（0.96±0.06）、（0.99±0.07）、（1.00±0.05），CV分别为6.66%、6.56%、6.69%、5.18%，均＜10%，见表7。表明最佳解离液及解离条件适用于不同批次供试品的解离。

表3 重复性验证结果Tab.3 Verification for reproducibility

表4 中间精密性验证结果Tab.4 Verification for intermediate precision

表5 不同解离时间的检测结果Tab.5 Determination results of samples dissociated for various hours

表6 终止反应后放置不同时间的检测结果Tab.6 Determination results of samples stored for various minutes after termination of reaction

表7 适用性验证结果Tab.7 Verification for applicability

3 讨 论

目前，全球范围内至少已有4款新型冠状病毒灭活疫苗获批上市［1］，生产厂家包括武汉生物、北京生物制品研究所有限责任公司、北京科兴中维生物有限公司、印度Bharat Biotech公司，这4款疫苗均使用了铝佐剂［2，11-13］。武汉生物研发的新型冠状病毒灭活疫苗在阿联酋等国家进行了国际多中心、随机、双盲、安慰剂平行对照的Ⅲ期临床试验，结果表明，2针免疫程序接种后，中和抗体阳转率超过99%，总体保护效力超过70%［15］，达到世界卫生组织（WHO）及国家药品监督管理局相关标准要求［16］。灭活疫苗的关键成分在产品质量控制中应得到准确定量，才能有效评价产品质量属性。新型冠状病毒灭活疫苗的有效抗原主要包括S、M和N蛋白，目前多采用ELISA法进行抗原含量检测。

有研究表明，位于SARS-CoV-2囊膜上的疫苗关键抗原易受到溶液酸碱度、离子强度、流体力学和储存条件等因素的影响，抗原蛋白结构在强解离过程中可能会发生变性，从而影响抗原含量的准确定量检测［7-8］。因此，解离液配方和解离条件的选择需综合考虑解离率以及对抗原蛋白结构的影响，选择能够稳定溶液体系，使抗原从铝佐剂上快速解离，同时保护抗原表位结构，不影响抗原免疫活性的解离液和解离条件显得尤为重要［7］。本研究共配制了6种解离液，其中解离液5［0.1%（v／v）TritonX-100，0.1 mol／L EDTA，0.05%（v／v）Tween20］的解离率最高。解离液与供试品按1∶1的体积比混合，于37℃放置20 h，是最佳解离条件。为排除解离液5的成分对抗原定量检测的干扰，本研究选择未吸附铝佐剂的新型冠状病毒灭活疫苗原液作为供试品，检测加入解离液5与不加解离液5的区别，结果表明，两者差异无统计学意义（P＞0.05），表明解离液5的成分不干扰抗原检测结果。同时，对最佳解离液和解离条件进行了准确性、精密性、耐用性和适用性验证，准确性验证结果表明，样品回收率在98.13%～100.63%之间；精密性验证结果表明，不同日期及不同实验员重复检测结果的CV均＜10%；耐用性验证结果表明，供试品解离16、20、24 h后检测结果的CV均＜10%，ELISA检测中终止反应后放置0、10、20 min检测的CV均＜1%；适用性验证结果表明，4批新型冠状病毒灭活疫苗成品检测结果的CV均＜10%。上述结果表明，解离液5及最佳解离条件在新型冠状病毒灭活疫苗抗原ELISA检测试剂盒中的应用具有良好的准确性、精密性、耐用性和适用性。

综上所述，本研究选择的最佳解离液和解离条件效果好，干扰小、重复性和适用性好，为新型冠状病毒灭活疫苗体外效力的检测提供了可靠的检测方法。