2015—2019年森林脑炎灭活疫苗批签发质量分析

刘晶晶，李玉华

中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室，北京 102629

森林脑炎（forest encephalitis）又名蜱传脑炎（tickborne encephalitis，TBE），是由森林脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的一种以入侵中枢神经系统为主要特征的急性传染病，致死率高达20%～30%［1］。我国《人间传染的病原微生物名录》将TBEV定为第一类危害程度的高风险微生物。TBE的流行对欧亚大陆的公共卫生安全造成了严重威胁。近年，我国报告的TBE发病率呈上升趋势，东北、西北和西南为主要发病地区［2］。目前，尚无针对TBE的特异性治疗方法及药物，接种疫苗是预防其传播的最有效方法［3］。美国GSK公司生产的TBE疫苗Ⅳ期临床试验结果表明，加强免疫TBE疫苗后，10年内可维持较高的中和抗体水平［4］。1952年，我国科学工作者从TBE患者脑组织中分离出TBEV，命名为“森张”株，其为前苏联远东型病毒，用于森林脑炎疫苗的研发［5］，2004年经原国家食品药品监督管理局审批，2005年正式于国内上市。目前，我国使用的森林脑炎灭活疫苗是以原代地鼠肾细胞为细胞基质的纯化疫苗（商品名：森泰保），该疫苗免疫后的阳转率达86.8%，局部反应发生率仅为0.13%，显示了良好的安全性和免疫原性［6-5］；Ⅳ期临床试验的前期结果显示，加强免疫该疫苗可为受试者提供3年以上的保护［7-8］。

我国对森林脑炎灭活疫苗规定的质量标准收录在《中国药典》三部（2015版）中［9］，且采用批签发形式，以确保上市疫苗的安全性及有效性。为提高森林脑炎灭活疫苗的质量监管力度，及时有效地进行监测，确保其质量可控，本研究对自完成2013年场地变更后，2015—2019年申报批签发的47批，共计116.5万人份森林脑炎疫苗的安全性及有效性指标进行趋势分析，并将中国食品药品检定研究院（简称中检院）与企业自检结果进行比较，以期为该疫苗后续批次的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 疫苗2015—2019年申报批签发的47批，共计116.5万人份森林脑炎灭活疫苗均由长春生物制品研究所有限责任公司生产。

1.2 病毒“森张”株TBEV由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

1.3 主要试剂 乙二胺四乙酸二钠滴定液及锌滴定液购自中国食品药品检定研究院；二甲酚橙、盐酸羟胺及双硫腙购自国药集团化学试剂有限公司；汞单元素溶液标准物质购自中国计量研究院。

1.4 实验动物SPF级昆明小鼠，30只，雌性，18～21日龄，体质量10～12 g，由长春生物制品研究所有限责任公司提供，动物合格证号为：201600014430。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行。

1.5 检测方法

企业按照《中国药典》三部（2015版）［9］中规定的方法，对47批森林脑炎灭活疫苗的效价、氢氧化铝含量及硫柳汞含量进行测定；中检院抽取16批疫苗进行效价测定，6批疫苗进行氢氧化铝含量测定，6批疫苗进行硫柳汞含量测定。

1.5.1 效价测定 将待检样品经腹腔免疫30只小鼠，0.3 mL／只，共免疫2次，间隔7 d；同时设空白对照组，30只，不进行处理。初次免疫后14 d，试验组及空白对照组分别以10-2～10-6稀释度和10-6～10-10稀释度的“森张”株TBEV悬液进行腹腔攻击，每个病毒稀释度攻击6只小鼠，均0.3 mL／只。攻击后3 d内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），连续21 d观察小鼠存活情况［9］。

1.5.2 氢氧化铝含量测定 精密量取待检样品5 mL，置250 mL锥形瓶中，加入磷酸溶液1.5 mL，完全溶解。精密加入乙二胺四乙酸二钠滴定液（0.05 mol／L）及醋酸-醋酸铵缓冲液（pH 4.5）各10 mL，沸水浴加热10 min；冷却至室温，加入二甲酚橙指示液1 mL，用锌滴定液（0.025 mol／L）进行滴定，当溶液由亮黄色变为橙色，即为终点［9］。

1.5.3 硫柳汞含量测定 精密量取待检样品1 mL，置3 cm×24 cm试管中，加盖，于85～90℃水浴加热1 h；冷却后加入去离子水至40 mL，再加入20%盐酸羟胺溶液5 mL。用40 mL的去离子水将上述溶液分3次冲洗至125 mL分液漏斗中，再用双硫腙滴定液进行滴定，每次加入滴定液后，振摇10 s，静置分层，弃四氯化碳层，继续滴定，直至双硫腙溶液的绿色保持不变，即为终点［9］。

1.6 数据分析 收集企业47批森林脑炎灭活疫苗的检测结果，当平均值和标准差（SD）趋于稳定时，暂时固定平均值和SD，即在连续趋势分析中不再随着新增的检验结果重新计算平均值和SD，避免因引入新的检测数据而掩盖检测结果发生偏移的情况。中检院检测结果数少于40个，数据监测需随着数据积累添加每个新的检测结果，并重新计算平均值和SD。均以平均值±2SD为警戒限，平均值±3SD为行动限，作为数据纠偏依据；数据较少时，不设警戒限和行动限［10］。

1.7 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，中检院和企业测定的效价、氢氧化铝含量及硫柳汞含量结果的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 森林脑炎灭活疫苗关键质量控制项目数据的比较中检院仅对6批森林脑炎疫苗中氢氧化铝和硫柳汞含量进行了测定，获得相应数据较少，因此未确定警戒限和行动限。中检院和企业测定的森林脑炎灭活疫苗效价平均值分别为8.1和8.0 lgLD50／0.3 mL，两者差异无统计学意义（t=0.547，P＞0.05）；氢氧化铝含量平均值分别为0.56和0.43 mg／mL，两者差异有统计学意义（t=3.653，P＞0.05）；硫柳汞含量平均值分别为53和54µg／mL，两者差异无统计学意义（t=1.464，P＞0.05）。见表1。表明中检院和企业测定的氢氧化铝含量结果差异有统计学意义；两个实验室对效价和硫柳汞含量测定结果的一致性在可接受的范围内。

2.2 森林脑炎灭活疫苗关键质量控制项目结果的趋势分析

2.2.1 效价 企业的效价测定结果中有2个不连续批次超出行动下限，但均在质量标准范围内，这2批疫苗是生产场地变更后起始阶段生产的，尚在趋势分析数据收集阶段，其他数据无过高或过低的情况，也未见连续3批超出警戒限的批次。中检院效价测定结果的数据监测显示，在生产场地变更后起始阶段生产的1批疫苗超出警戒下限，未见超出行动限和连续3批超出警戒限的批次。见图1。总体上，企业的趋势分析结果与中检院数据监测结果较为稳定，一致性良好。

2.2.2 氢氧化铝含量 企业测定氢氧化铝含量的结果均未超出警戒限，均在其质量标准的范围内，且趋势未见严重漂移，批间一致性良好，企业针对该项目的生产工艺较稳定，见图2。中检院的测定结果均符合其质量标准，结果未超过6个数据，无法显示趋势。

图1 森林脑炎灭活疫苗效价测定结果趋势分析Fig.1 Trend analysis of titer determination results of inactivated TBE vaccine

图2 森林脑炎灭活疫苗氢氧化铝含量测定结果的趋势分析Fig.2 Trend analysis of determination results of aluminium hydroxide content of inactivated TBE vaccine

表1 森林脑炎灭活疫苗关键质量控制项目的检测结果Tab.1 Test results of critical quality control indicators of inactivated TBE vaccine

2.2.3 硫柳汞含量 企业测定的柳硫汞含量结果均未超出警戒限，均在其质量标准的范围内，在初始数据收集阶段，存在一定的数据漂移现象，待生产工艺稳定后，后期批次的测定结果趋于一致，见图3。中检院的测定结果均符合其质量标准，结果未超过6个数据，无法显示趋势。

图3 森林脑炎灭活疫苗硫柳汞含量测定结果的趋势分析Fig.3 Trend analysis of determination results of thiomersalate content of inactivated TBE vaccine

3 讨论

随着生物制药技术的发展和新版疫苗批签发指导原则的实施，对疫苗关键指标的质量控制更加完善。其中趋势分析作为批签发的组成部分，对监测疫苗生产过程中的稳定性、不同批次的批间一致性起到重要的作用。本研究就森林脑炎灭活疫苗安全性、有效性评价中的效价、氢氧化铝含量和硫柳汞含量测定项目，对2015—2019年间的47批疫苗进行了数据监测和趋势分析。由于森林脑炎灭活疫苗的生产批次较少，且批签发实行动态抽检方式，因此中检院的试验结果仅进行数据监测。

疫苗有效性是衡量抗原诱导机体产生免疫应答反应达到预期保护效果的重要指标，效价测定是评价疫苗有效性、监测批间一致性的关键手段之一［11］。本研究结果显示，从效价测定结果的趋势分析来看，除生产场地变更起始阶段有个别数据波动外，未发现有严重偏移现象，结果均符合质量标准，疫苗有效性和批间一致性较好，质量较为稳定。

铝佐剂是目前应用最为广泛的疫苗佐剂，已有的研究结果认为铝佐剂具有抗原储存、提高机体固有免疫应答、增强抗原递呈、增强Th2细胞介导的适应性免疫应答、激活B细胞诱导抗体产生、激活补体等作用［12］，但作用机理尚未明确。考虑到抗原应答和疫苗长期免疫效应的关系，国家药品监督管理局建议结合铝佐剂和疫苗质量趋势分析对铝佐剂质量稳定性进行定期分析［13］。本研究对森林脑炎灭活疫苗的氢氧化铝含量测定结果的趋势分析中，未发现超出警戒限的数据，整体趋势良好；统计分析结果显示，中检院与企业的氢氧化铝含量测定结果存在差异（P＜0.05），可能与样本量较少有关，还需进一步积累数据进行分析。

WHO自2002年起对有关使用硫柳汞作为疫苗防腐剂和灭活剂的相关科学证据进行了多年的密切监测，特别是全球疫苗安全咨询委员会，对硫柳汞与自闭症等42项神经发育疾病的相关性进行了评估，该委员会认为，目前无证据表明疫苗中的硫柳汞会对健康构成风险［14］。但作为预防措施，WHO等机构已启动了减少和／或消除硫柳汞使用的措施［15］，硫柳汞已从大多数发达国家儿童计划免疫的疫苗中去除［16］。本研究对森林脑炎灭活疫苗中硫柳汞含量的趋势分析表明，在生产场地变更后早期生产的疫苗，出现了一定的数据漂移现象，随着生产工艺的稳定，总体质量趋于稳定，所有测定结果均符合质量标准。为响应WHO的建议，进一步提高疫苗质量，企业开展了硫柳汞去除工艺的研究，在减少添加剂使用、保障安全性方面，进行了疫苗生产工艺的改进，去除硫柳汞等工艺变更后的疫苗现已正式上市。

从疫苗整体的趋势分析上看，森林脑炎灭活疫苗的生产工艺和产品质量较为稳定，随后的质量控制过程中，仍需进行关键指标的动态监测，及时发现可能的异常数据，溯源生产和质控系统。对工艺变更后的疫苗，做好数据积累和比对工作。