化脓隐秘杆菌溶血素和铁结合蛋白的抗体应答分析

刘德珍，沈克飞，付利芝，徐登峰，张素辉

1.重庆市荣昌区人民医院 重庆 402460；2.重庆市畜牧科学院 重庆 402460

化脓性感染是一种常见的接触性传染病，由化脓菌（pyogenic bacteria）通过受损皮肤或黏膜感染而引起，造成组织化脓性或坏死性病变。化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）是动物化脓性感染的常见病原菌，人通过与患病动物的密切接触也能被其感染［1-4］。化脓隐秘杆菌在山羊化脓性感染病例中分离率较高［5］，感染主要引发山羊淋巴结炎、牙龈炎、化脓性肺炎、流产、死胎等临床症状［5-7］，其中化脓性肺炎对山羊健康危害最大。化脓隐秘杆菌感染引发的山羊肺炎一般为慢性消耗性疾病［8］，感染早期不易被发现，表现出临床症状时又因细菌耐药性而难以治疗［9］，影响羔羊成活率，降低了养殖经济效益。化脓隐秘杆菌为革兰阳性菌，是动物皮肤、上呼吸道和泌尿生殖道黏膜微生物群落的一部分，同时也是一种重要的机会致病菌［1］。

目前，在化脓隐秘杆菌感染、免疫中抗体应答方面的研究报道不多。化脓隐秘杆菌已报道的抗原有溶血素（pyolysin，PLO）和铁ATP结合盒（ATP binding cassette，ABC）转运体的底物结合蛋白——铁结合蛋白（iron-binding protein，IBP）等，PLO和IBP在分离株中普遍存在，也是该菌的免疫保护性抗原［1，10-11］，研究两者在感染和疫苗免疫过程中的抗体应答，可为血清学检测靶标选择及疫苗研发提供理论指导和数据支持。另外，尽管化脓隐秘杆菌是山羊化脓性感染的常见病原菌，但对其流行情况了解不多。为此，本研究利用ELISA方法测定感染模型、圈养羔羊、免疫动物血清中抗PLO和IBP的IgG抗体水平，以期了解感染强度、组织损伤与抗PLO抗体水平的相关性及免疫动物中PLO和IBP的抗体应答情况，为化脓隐秘杆菌感染的鉴定及评价灭活苗免疫效果的血清学检测靶标选择提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株及血清 化脓隐秘杆菌山羊分离株由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所分离、鉴定及提供［6］，rPLO小鼠抗血清、表达rPLO（37-281位氨基酸残基）（pET-28a-PLO）［12］和rIBP（pGEX-4T-1-IBP）［11］的重组大肠埃希菌BL21（DE3）、化脓隐秘杆菌阴性山羊血清［12］均由该所保存和提供；540份羔羊血清采自重庆地区规模化山羊养殖场，羔羊无体表脓肿和呼吸道疾病，圈养。

1.2 主要试剂及仪器TSA、TSB、蛋白胨和酵母提取物均购自北京经科宏达生物技术有限公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体和HRP标记的兔抗山羊IgG抗体均购自美国EarthOx Life Sciences公司；Gluthathione-Sepharose 4B和Ni-NTA填料购自北京诺和生物技术有限公司；Quick Start Bradford购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；BCTP／NBT购自生工生物工程（上海）股份有限公司；TMB单组分显色液购自索莱宝生物科技有限公司；酶标板购自康宁生命科学（吴江）有限公司；明胶购自广州赛国生物科技有限公司。

1.3 实验动物SPF级昆明小鼠，雌性，6～8周龄，体质量约为25 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2019-0008；用于免疫的山羊为3月龄羔羊，由重庆某规模化山羊养殖场提供。本实验均以科研为目的对实验动物进行养殖和使用，且按照重庆市畜牧科学院实验动物伦理委员会动物伦理相关规定进行（文件号：C9aa2020014）。

1.4 细菌培养 将化脓隐秘杆菌单菌落接种于含8%小牛血清的TSB培养基，37℃振摇培养48 h；将新鲜培养的细菌用PBS进行10倍系列稀释后涂布于含8%小牛血清的TSA平板上，置于37℃培养箱中培养，长成可见菌落后进行平板菌落计数。

1.5 小鼠感染模型的建立 将PBS和新鲜培养的100～10-5稀释的化脓隐秘杆菌，采用腹腔注射方式接种健康昆明小鼠［12］，0.2 mL／只，各注射20只。观察小鼠死亡、注射部位病变情况。以注射部位未出现组织病变剂量对20只健康小鼠腹腔注射新鲜培养的化脓隐秘杆菌，间隔2 d注射1次，连续3次，观察小鼠死亡、注射部位皮肤病变情况。最后1次注射后的2、4、8周，随机各取5只小鼠，经眶前静脉窦采血，分离血清，用于抗体水平检测。

1.6 PLO检测 新鲜培养的化脓隐秘杆菌经6 000×g离心10 min，保留上清，经0.22µm滤膜过滤后，用截留分子量为10 000的膜块进行超滤浓缩，最终浓缩液体积约为初始体积的1／10。Western blot法鉴定浓缩液中的PLO：浓缩液样品经12% SDS-PAGE分离后转印至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；TBST洗涤3次，与rPLO小鼠抗血清（1∶100稀释）室温孵育1 h；TBST洗涤3次，与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀释）室温孵育1 h；最后置BCTP／NBT中显色。PLO相对分子质量为54 500。

1.7 动物免疫 向新鲜的化脓隐秘杆菌培养物（≥1×1010CFU／mL）中加入0.2%甲醛溶液，37℃灭活24 h，每6 h振摇1次。向无菌检验合格的灭活细菌培养物中加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂制备成抗原。采用肌肉注射途径免疫动物，每只小鼠0.2 mL，共45只；每只山羊1 mL，共10只。小鼠和山羊均进行3次免疫，每次间隔2周。第1次免疫使用弗氏完全佐剂制备的抗原，加强免疫使用弗氏不完全佐剂制备的抗原。第3次免疫后2周采集小鼠眶前静脉血或山羊静脉血，分离血清，用于抗体水平检测。

1.8 重组蛋白的制备 将含pET-28a-PLO和pGEX-4T-1-IBP的重组大肠埃希菌BL21（DE3）分别接种至LB培养基中，37℃，180 r／min振摇培养至菌体A600约为0.6时，加入终浓度0.1 mmol／L的IPTG，37℃下诱导表达3 h，收集菌体。冰水浴中超声裂解菌体（超声功率为300 W，工作4 s间歇5 s，超声裂解15 min）。采用Ni-NTA或Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析法从裂解菌体中纯化rPLO或rIBP，12% SDS-PAGE分析纯化结果（rPLO和rIBP相对分子质量分别为29 000和57 500）。经0.22µm滤器过滤后，采用Quick Start Bradford测定蛋白质浓度。

1.9 抗原包被酶标板的制备 制备rPLO和rIBP包被的酶标板，分别称为rPLO-ELISA和rIBP-ELISA：采用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释抗原rPLO和rIBP，每孔加入稀释抗原100µL，抗原用量为0.2µg，4℃包被过夜；用200µL PBST洗涤3次，加入2%明胶溶液，200µL／孔，37℃封闭2 h；用200µL PBST洗涤3次，备用。

1.10 血清抗体水平检测 将小鼠感染模型、圈养羔羊、免疫动物血清1∶100稀释，加入包被酶标板孔中，100µL／孔，37℃孵育1 h；用200µL PBST洗涤3次，加入酶标抗体（1∶20 000稀释），100µL／孔，37℃孵育1 h；用200µL PBST洗涤3次，加入TMB单组分显色液，100µL／孔，室温反应10 min；加入2 mol／L硫酸溶液，50µL／孔，终止反应，使用酶标仪测定波长450 nm处吸光度值。测定结果以A450平均值（）±标准差（SD）表示。计算PBS注射小鼠血清、化脓隐秘杆菌阴性山羊血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISAA450的和SD，以样本的A450＞+3SD时判为阳性，设定阴阳性临界值=+3SD［12］。

2 结果

2.1 小鼠感染模型的建立 腹腔注射不同稀释度的化脓隐秘杆菌，随着细菌数量的降低，小鼠从死亡、注射部位出现化脓及皮肤坏死到不表现出明显症状。注射2×109CFU以上细菌对小鼠致死率高于80%，小鼠在1周内死亡，存活小鼠注射部位出现化脓及皮肤坏死，见图1；（1～8）×108CFU细菌对小鼠无致死性，所有小鼠注射部位出现化脓及皮肤坏死；注射5×107CFU以下细菌，所有小鼠注射部位未出现化脓、皮肤坏死及死亡；间隔2 d连续3次注射2×107CFU细菌，所有小鼠注射部位未出现化脓、皮肤坏死及死亡。PBS注射小鼠未出现化脓和皮肤坏死症状。

图1 小鼠接种部位组织病变Fig.1 Tissue lesion of mice in injection site

2.2 PLO检测Western blot分析显示，超滤浓缩的化脓隐秘杆菌培养物上清与rPLO小鼠抗血清反应显现1条带，相对分子质量约为55 000，与PLO预期大小相符，见图2。表明化脓隐秘杆菌用含8%小牛血清的TSB培养基在37℃振摇培养48 h有PLO分泌。

图2 化脓隐秘杆菌PLO的Western blot分析Fig.2 Western blotting of PLO of T.pyogenes

2.3 重组蛋白的纯化 重组菌经IPTG诱导后，利用Ni-NTA从含pET-28a-PLO的重组菌中纯化得到rPLO，浓度为1.21 mg／mL，纯度为95%；利用Gluthathione-Sepharose 4B从含pGEX-4T-1-IBP的重组菌中纯化得到rIBP，浓度为0.84 mg／mL，纯度为88%。见图3。

2.4 血清抗体水平

2.4.1 小鼠感染模型血清 以PBS注射小鼠血清rPLOELISA和rIBP-ELISAA450的x+3SD确定小鼠血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISA的阴阳性临界值，结果分别为0.345和0.382。腹腔注射化脓隐秘杆菌2周后，注射1×108CFU以上细菌的存活小鼠和连续注射2×107CFU细菌小鼠血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISAA450均远高于临界值，见表1。注射后2、4、8周，单次注射5×107CFU以下细菌的小鼠仅能检测到低水平的抗IBP抗体，检测不到明显的抗PLO抗体。

图3 重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified recombinant proteins

表1 ELISA法检测腹腔注射化脓隐秘杆菌后2周小鼠血清中抗PLO和IBP的IgG抗体水平（A450，x±SD，n=5）Tab.1 Determination of IgG levels against PLO and IBP in sera of mice 2 weeks after intraperitoneal injection with T.pyogenes by ELISA（A450，x±SD，n=5）

2.4.2 临床圈养羔羊血清 以化脓隐秘杆菌阴性山羊血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISAA450的x+3SD确定山羊血清rPLO-ELISA和rIBP-ELISA的阴阳性临界值，结果分别为0.466和0.388。540份圈养羔羊血清rPLO-ELISA的阳性率为26.38%，rIBP-ELISA的阳性率为11.11%，rIBP-ELISA与rPLO-ELISA的阳性符合率为100%，但rPLO-ELISA和rIBP-ELISA读值均偏低。

2.4.3 免疫动物血清 第3次免疫后2周，30%小鼠血清rPLO-ELISAA450低于阴阳性临界值，33.3%山羊血清rPLO-ELISAA450低于阴阳性临界值，而对应血清的rIBP-ELISA检测结果为阳性，见表2。表明灭活化脓隐秘杆菌不能使所有免疫动物产生抗PLO的IgG抗体，但能产生抗IBP的IgG抗体。

表2 ELISA法检测化脓隐秘杆菌免疫动物血清中抗PLO和IBP的IgG抗体水平（A450，x±SD）Tab.2 Determination of IgG levels against PLO and IBP in sera of animals immunized with T.pyogenes by ELISA（A450，x±SD）

3 讨 论

冯峰［13］通过腹腔注射化脓隐秘杆菌研究其对小鼠的致病性，结果表明，该菌可感染小鼠。化脓隐秘杆菌的毒力与plo基因的表达水平有关，感染宿主体内plo基因表达水平高的菌株毒力更强［14］。PLO是化脓隐秘杆菌分泌的唯一外毒素，能溶解包括红细胞在内的多种细胞。PLO的细胞溶解活性能使细菌获得在宿主体内复制所必需的游离铁和其他生长因子，对化脓隐秘杆菌体内生存和疾病发展具有重要意义［1］。在很多研究中，使用细胞模型和动物感染模型对PLO与疾病发展的相关性进行评估，应用培养的牛子宫内膜细胞阐明了PLO参与组织损伤，在小鼠模型中进行的研究表明PLO与腹膜炎有关，PLO对小鼠和兔子有致死作用，静脉和腹腔注射后对豚鼠有皮肤坏死作用［1，14-17］。腹腔注射1×108CFU以上化脓隐秘杆菌，引发小鼠注射部位出现化脓和皮肤坏死，甚至导致小鼠死亡，在存活小鼠血清中检测到高水平抗PLO抗体。腹腔注射5×107CFU以下化脓隐秘杆菌，小鼠注射部位未观察到组织病变，血清中检测不到明显的抗PLO抗体，而在连续注射小鼠血清中均检测到高水平的抗PLO抗体。表明抗PLO的抗体水平与机体感染的化脓隐秘杆菌数量或感染频率呈正相关，与组织病变相关，提示PLO的表达水平高低可能与感染造成的组织损伤程度呈正相关。圈养羔羊体内低抗PLO抗体水平与无体表脓肿和呼吸道疾病症状，也间接说明抗PLO抗体水平与临床症状相关。

铁是一种必需微量元素，参与细菌多种关键代谢途径，包括生物合成、DNA复制、转录、呼吸和氧化应激反应等［18］。病原菌拥有高效的铁摄取系统，以维持体内外生存和毒力，抵御宿主的杀菌作用［19］。革兰阳性细菌铁摄取系统主要有铁ABC转运体、二价金属离子ABC转运体、血红素ABC转运体等［20］，它们在不同的宿主体内微环境中会出现差异表达，以适应病原菌在体内的生存环境。在腹腔注射的感染模型中，除了在出现化脓和皮肤坏死的小鼠血清中检测到抗IBP抗体，在未观察到注射部位组织病变的小鼠血清中检测到一定水平的抗IBP抗体，表明IBP在化脓隐秘杆菌通过腹腔注射途径的感染过程中表达，提示化脓隐秘杆菌在该感染途径中可能通过铁ABC转运体从宿主体内摄取铁元素。

化脓隐秘杆菌感染能刺激机体产生感染或免疫能刺激机体产生抗PLO特异性抗体，基于抗PLO抗体的间接ELISA法具有良好的特异性［12，21］。圈养羔羊血清中抗PLO的IgG抗体阳性率高，表明化脓隐秘杆菌在圈养羔羊群体中的感染率很高，尽管感染强度不高，提示化脓隐秘杆菌对圈养羔羊健康有潜在威胁。高感染率可能是造成化脓隐秘杆菌在山羊肺炎病例中高分离率的原因［5］。圈养羔羊化脓隐秘杆菌高感染率提示防控化脓隐秘杆菌感染需保持好圈舍清洁卫生和提高饲养管理水平。

虽然化脓隐秘杆菌在含8%小牛血清的TSB培养基中37℃振摇培养48 h有PLO分泌，但含量低，需浓缩才能通过Western blot检测出来。用分泌有PLO的灭活化脓隐秘杆菌培养物免疫小鼠和山羊，均有部分动物未产生PLO抗体，可能与PLO含量太低、免疫动物个体差异等因素有关。培养基营养、培养条件等因素会影响化脓隐秘杆菌毒力因子的表达及表达水平［10］，考虑到PLO是化脓隐秘杆菌的主要毒力因子和保护性抗原，在灭活疫苗研制中需筛选利于提高体外培养过程中PLO分泌水平的培养基营养、培养条件。鉴于不同浓度的PLO对免疫机体免疫功能的影响不同［1］，考查PLO的活性可能也是化脓隐秘杆菌免疫中应注意的问题。考虑到伪结核棒状杆菌感染小鼠血清与rIBP有明显的交叉反应［21］，且抗PLO抗体水平与感染强度、组织损伤强度有关，rPLO-ELISA更适用于检测化脓隐秘杆菌临床感染情况、评价化脓隐秘杆菌灭活疫苗的免疫预防效果。