绿色荧光蛋白标记的BHK-21细胞源性外泌体的构建及鉴定

张娟，鲁明，朱海莲，何丽存，顾冉，李代英，3，陈俊英，3，潘玥，3，孙强明，3

1.昆明医科大学，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南 昆明 650118；3.云南省虫媒传染病防控研究重点实验室，云南 普洱 665000

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是由活细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的外囊泡，直径为30～150 nm，密度在1.10～1.20 g／mL之间［1］。起初，外泌体被当作细胞的“代谢废物”，随着研究的深入，研究者发现外泌体在生物体的生理学和病理学中发挥着重要作用［2］。外泌体可包裹蛋白质、核酸、脂质等生物活性分子，经过“内吞-融合-外排”等一系列过程到达机体各处，进行物质运输和信号转导［3-5］。

登革病毒（Dengue virus，DENV）为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，包括4种不同的血清型，每一型均具有传染性且能致病［6-7］。DENV通过白纹伊蚊和埃及伊蚊叮咬后传播，引发登革热，是全球分布最广、发病较多、危害较大的一种虫媒病疾病［8］。乳仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney，BHK）是培养和分离DENV的哺乳细胞系之一，该细胞易培养，增殖快，对病毒易感，在研发和生产中应用非常广泛［9］。

外泌体的形成和释放依赖多泡体（multivesicular bodies，MVBs）与质膜的融合，病毒作为细胞内寄生物，必须在细胞内才能完成复制周期从而产生新的感染性病毒粒子，该过程需要胞内囊泡的参与［10-11］。研究发现，从猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive respiratory syndrome，PRRS）、甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染细胞上清中提取的外泌体中包含病毒核酸，可在受体细胞中建立新的感染且无法被病毒特异性中和抗体阻断［12-14］。病毒能利用外泌体在宿主靶细胞之间自由穿梭和准确定位的特点，将自身基因组和蛋白等病毒组分载入外泌体中，随体液循环到达机体各处，导致免疫功能的失调，造成病毒扩散及产生免疫抑制［15］。越来越多的研究表明，外泌体在DENV感染细胞过程中发挥重要作用，ZHU等［16］发现，干扰素诱导的跨膜转运蛋白3（interferoninduced transmembrane protein 3，IFITM3）能够通过外泌体在细胞间进行交流，从而阻止DENV进入细胞。另有研究证实，DENV感染C6／36细胞分泌的外泌体中包含病毒核酸和蛋白，这些外泌体可在未感染的细胞中建立感染［17-18］。

本研究通过构建筛选出一种能稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和外泌体标志蛋白CD63的BHK-21细胞系，进一步得到GFP标记的BHK-21源性外泌体并进行鉴定，最后通过共培养和Transwell试验对外泌体进行示踪，观察外泌体在受体细胞中的摄取情况以及DENV感染后细胞外泌体分泌量的变化，为后续研究外泌体在病毒感染过程中的信号传递和细胞间物质转移机制提供有力的工具。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞及质粒 Ⅲ型登革病毒株（基因序列号：KR296744）、BHK-21和293T细胞均由中国医学科学院医学生物学研究所分子流行病研究室保存；pCT-CD63-GFP（CYTO120-PA-1）慢病毒表达质粒购自美国SBI公司；pVS-VG（Env）包膜质粒和pSPAX（structure）质粒由美国马里兰大学Basile John博士惠赠；E.coliDH5α感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 聚凝胺、嘌呤霉素和质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；UItra-Fection 3.0高效转染试剂购自四正柏生物科技（北京）有限公司；mRNA selective PCR kit购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA酶抑制剂和Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；鼠抗CD63、CD81单克隆抗体购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG和鼠抗GAPDH单克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；DIO染液和BSA购自北京索莱宝科技有限公司；ZetaView仪购自德国Particle Metrix公司。

1.3 质粒扩增及提取 取100µL冰上融化的E.coliDH5α感受态细胞，加入目的质粒pCT-CD63-GFP，轻轻混匀，冰上静置30 min；42℃水浴热激45 s，迅速转移至冰浴中，静置2 min；向离心管中加入500µL无抗性LB培养液，37℃，200 r／min复苏60 min；取合适体积的复苏液均匀涂布至氨苄抗性（100µg／mL）的LB固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜；待培养基上长出明显的菌落，挑取单个菌落，在LB（Amp+）液体培养基中混匀，37℃，200 r／min振荡培养12～13 h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。

1.4 慢病毒包装及滴度测定 以2.5×106个／皿的密度将293T细胞接种至10 cm培养皿，待细胞长成单层后，利用UItraFection 3.0高效转染试剂将pVSVG（Env）包膜质粒、pSPAX（structure）质粒和pCTCD63-GFP表达质粒共转染293T细胞。转染8 h后，弃去含有转染混合液的培养基，加入新鲜完全培养基继续培养，分别于更换培养基24、48和72 h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清，使用0.22µm滤膜对病毒液进行过滤后，分装保存至-80℃冰箱。滴度检测前24 h，将状态良好的293T细胞接种至96孔板，培养24 h后，将收获的病毒原液连续10倍系列稀释（10-1～10-5），加入板中，100µL／孔，同时设空白对照组，培养48 h；加入100µL新鲜培养基，37℃，5%CO2培养箱培养4 d。荧光显微镜下观察，利用倍比稀释法检测慢病毒滴度，对荧光比例合适（10%～30%）的孔进行细胞计数，按下式计算病毒滴度。

1.5 慢病毒感染BHK-21细胞 取生长状态良好的BHK-21细胞，胰酶消化后加入新鲜培养基，铺入6孔板中，2 mL／孔，37℃，5% CO2培养箱中培养12～18 h；待细胞密度长至80%时，加入慢病毒和聚凝胺，轻轻混匀，至细胞培养箱培养过夜；48和72 h后荧光显微镜下观察荧光信号。

1.6 稳定表达GFP-CD63 BHK-21细胞株的筛选将BHK-21细胞按4×104个／孔的密度接种24孔板，待其长至单层，依次加入终浓度为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10µg／mL的嘌呤霉素，37℃，5% CO2培养箱中继续培养。每日观察细胞存活率，确定抗生素筛选开始4～6 d内有效杀死非转染细胞的药物最低浓度。

取出经慢病毒感染的靶细胞，加入最佳浓度的嘌呤霉素，每隔3 d更换新的含嘌呤霉素的细胞培养液，继续筛选。筛选2周后出现细胞克隆，荧光显微镜下挑取单个绿色荧光标记的细胞株，进行扩大培养。

1.7 稳定转染细胞株中CD63蛋白表达的检测 采用Western blot法。收取GFP-CD63-BHK-21和BHK-21细胞总蛋白，经12% SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；分别加入抗CD63和GAPDH单克隆抗体（均1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀释），室温孵育1 h。经ECL系统曝光显影后获得相应条带。

1.8 外泌体提取 取稳定表达GFP的BHK-21细胞株，用10%不含外泌体血清的DMEM培养基培养，36 h后收集细胞上清100 mL，按照以下步骤提取外泌体：4℃，300×g离心10 min去除细胞；2 000×g离心10 min去除死细胞；10 000×g离心30 min去除细胞碎片；100 000×g超速离心70 min，100µL PBS重悬沉淀，-80℃保存。

1.9 外泌体鉴定

1.9.1 标志蛋白CD63和CD81的检测 采用Western blot法。使用RIPA裂解液（含1% PMSF）裂解外泌体，测定蛋白浓度，确定上样量。样品与5×SDS变性缓冲液煮沸变性后，经12%SDS-PAGE分离蛋白，电转移至0.22µm PVDF膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入鼠抗CD63和CD81单克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃过夜；加入山羊抗鼠IgG（1∶2 000稀释），室温孵育1 h；ECL显影。以GFP-CD63-BHK-21细胞裂解液作为阳性对照。

1.9.2 形态特征观察 取10µL新鲜提取的外泌体，3%磷钨酸负染1～2 min，室温干燥后用透射显微镜观察外泌体形态。

1.9.3 粒径分析 将提取的外泌体沉淀用PBS稀释至合适浓度，使用Zetaview仪，通过纳米颗粒示踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技术检测外泌体粒子分布大小。

1.9.4 荧光显微镜观察 将20µL提取的外泌体样品，用PBS稀释至100µL，滴至载玻片上，荧光显微镜下观察荧光状态。

1.10 外泌体摄取试验 将BHK-21细胞接种至6孔板，置37℃，5% CO2细胞培养箱培养24 h；取20µg提取的GFP-CD63-BHK-21细胞源外泌体，与BHK-21细胞共培养6 h，同时以DIO标记的BSA作为对照；孵育结束后，DAPI染色5 min，荧光显微镜观察BHK-21细胞摄取外泌体情况。

1.11 DENV感染对外泌体释放影响的检测 采用Transwell法。将GFP-CD63-BHK-21细胞置于孔径为0.4µm的Transwell小室上室，下室为BHK-21细胞。DENV按MOI=1感染上室细胞，同时设PBS对照组，24 h后，通过荧光显微镜观察下室细胞的荧光强度，评估上室细胞外泌体的释放量。模式图见图1。

为了验证Transwell法的准确性，将GFP-CD63-BHK-21细胞接种至T75瓶中培养，待细胞融合度达80%时，按MOI=1接种DENV，同时设PBS对照组，感染2 h后，更换为含2%无外泌体血清的细胞维持液培养24 h，收集细胞上清液，提取外泌体。通过NTA和Western blot法检测外泌体浓度。

图1 Transwell法检测外泌体释放的模式图Fig.1 Pattern diagram of determination of exosome release by Transwell assay

1.12 统计学分析 实验中所有数据均采用平均数±标准误差（mean±SEM）表示，通过Graphpad Prism 6软件，采用Student-t检验分析组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。每项试验重复3次。胞团，见图6B。挑取单个细胞扩大培养，重复筛选3次，最终获得1株可稳定表达GFP-CD63融合蛋白的BHK-21单克隆细胞株，命名为GFP-CD63-BHK-21。

图2 转染293T细胞包装病毒的荧光显微镜观察（×100）Fig.2 Fluorescence microscopy of 293T cells transfected with packaged virus（×100）

图3 慢病毒滴度检测（荧光显微镜，×100）Fig.3 Determination of lentivirus titer（fluorescence microscopy，×100）

2 结果

2.1 重组慢病毒的包装及滴度 荧光显微镜下观察可见，重组慢病毒表达质粒pCT-CD63-GFP与辅助质粒pVS-VG（Env）、pSPAX（structure）共转染293T细胞后24 h，GFP已表达；48 h时，GFP表达增多；72 h收集病毒液。见图2。慢病毒稀释至10-3时，荧光比例为20%，细胞总数为2×103个，病毒滴度=2×103×20%×103／0.01=4×107（TU／mL），见图3。

2.2 稳定表达GFP-CD63融合蛋白细胞株的筛选加入嘌呤霉素第5天，嘌呤霉素浓度为0µg／mL时，BHK-21细胞存活率为95%，形态正常；嘌呤霉素浓度为2µg／mL时，部分细胞皱缩变圆；嘌呤霉素浓度为3µg／mL时，细胞存活率为0%。见图4。因此确定在BHK-21细胞中，嘌呤霉素最佳筛选浓度为3µg／mL。重组慢病毒感染BHK-21细胞72 h后，荧光显微镜下观察可见，80%～90%的细胞表达绿色荧光，见图5。之后加入3µg／mL的嘌呤霉素进行筛选，36 h后细胞大量死亡，见图6A，携带嘌呤霉素抗性基因的细胞存活；经2周筛选，得到单克隆细

图4 BHK-21细胞加入不同浓度嘌呤霉素5 d后的倒置相差显微镜观察（×100）Fig.4 Inverted phase contrast microscopy of BHK-21 cells 5 d after addition with different concentrations of puromycin（×100）

图5 慢病毒感染BHK-21细胞的荧光显微镜观察（×100）Fig.5 Fluorescence microscopy of BHK-21 cells infected with lentivirus（×100）

图6 稳定表达GFP-CD63融合蛋白细胞系的筛选Fig.6 Screening of cell lines stably expressing GFP-CD63 fusion protein

2.3 稳定转染细胞株中CD63蛋白的表达Western blot分析显示，与BHK-21细胞相比，GFP-CD63-BHK-21细胞内CD63蛋白的表达量明显升高（t=-4.524，P=0.001），见图7。

图7 稳定转染细胞株的Western blot鉴定Fig.7 Western blotting of stably transfected cell lines

2.4 GFP-CD63-BHK-21源性外泌体的鉴定

2.4.1 标志蛋白CD63和CD81的检测Western blot分析显示，外泌体存在特异性标志蛋白CD63和CD81，见图8。

图8 Western blot检测外泌体标志蛋白CD63和CD81Fig.8 Western blotting of exosome marker proteins CD63 and CD81

2.4.2 形态特征 透射电镜观察可见，外泌体呈椭圆形，具有双凹圆盘状膜结构，直径在30～200 nm之间，见图9。

图9 外泌体的透射电镜观察（×20 000）Fig.9 Transmission electron microscopy of exosomes（×20 000）

2.4.3 粒径分析NTA检测显示，外泌体在110.2 nm处有峰值，见图10。

2.4.4 荧光显微镜观察 提纯后的外泌体发出强烈的绿色荧光信号，见图11。

2.5 外泌体摄取GFP-CD63-BHK-21细胞分离得到的外泌体与BHK-21细胞共培养6 h后，BHK-21细胞质内呈现绿色荧光颗粒，而DIO标记的BSA未观察到绿色荧光，表明外泌体可作为载体在细胞间进行物质转运。见图12。

2.6 DENV感染对外泌体释放的影响 试验结果显示，DENV感染24 h后，感染组的荧光强度高于PBS组，见图13。表明DENV可刺激细胞分泌外泌体，且供体细胞（GFP-CD63-BHK-21）产生的外泌体可被受体细胞（BHK-21）有效摄取。

NTA检测结果显示，DENV感染细胞上清中外泌体颗粒含量约为2.5×105个／mL，PBS组为1.2×105个／mL，病毒感染诱导外泌体释放量增加了2倍。Western blot结果同样证实了DENV感染可促进GFPCD63-BHK-21细胞外泌体的释放（t=13.816，P=0.000），见图14。

图10 粒径分析检测外泌体直径Fig.10 Exosome diameter determined by particlesize analysis

图11 荧光显微镜下观察提纯的外泌体（×100）Fig.11 Fluorescence microscopy of purified exosomes（×100）

图12 BHK-21细胞摄取外泌体的荧光显微镜观察（×400）Fig.12 Fluorescence microscopy of uptake of exosomes in BHK-21 cells（×400）

图13 荧光显微镜观察Transwell小室下室细胞的荧光强度（×100）Fig.13 Fluorescence microscopy of fluorescence intensity of cells in lower chamber of Transwell（×100）

图14 Western blot检测外泌体标志蛋白CD63的表达Fig.14 Western blotting of expression of exosome marker protein CD63

3 讨论

外泌体是一类由细胞分泌的直径为30～150 nm的细胞外囊泡，可转运蛋白质、核酸、脂质等多种生物活性分子，介导细胞间信息交流［19］。由于外泌体属于纳米颗粒，常规检测技术难以直接观测到，因此，在追踪外泌体在细胞间活动或活体动物体内行为时，需对外泌体进行标记。目前常用荧光染料、荧光蛋白、荧光素酶和物理标记等多种标记方法，不同的标记方法各有特点［20-22］。GFP是一种常用的报告蛋白，可利用自身结构催化形成生色团，将外泌体膜内外的蛋白分子与荧光蛋白偶联，构建出特定的融合蛋白，带荧光的膜蛋白会表达至外泌体膜上，通过检测融合蛋白发出的荧光信号对外泌体进行示踪分析［23］。与荧光染料法相比，GFP在标记活细胞和活性组织时无细胞毒性，灵敏度高，半衰期长，荧光性质稳定［24-25］。用GFP标记外泌体，易于荧光显微镜观察，更适用于实验周期较长的细胞和动物实验。

本研究构建了能够融合表达CD63外泌体标记蛋白和GFP的BHK-21细胞株，并进行外泌体的提取和鉴定。荧光显微镜观察可见，提取的外泌体均能发出绿色荧光。将外泌体与BHK-21细胞共培养，6 h后可在BHK-21细胞质内观察到大量绿色荧光颗粒，表明外泌体可被受体细胞所摄取。相对NTA和Western blot法，利用Transwell法检测外泌体释放量，通过检测下室受体细胞的荧光强度来评估上室细胞外泌体分泌量，操作简单且便于观察。研究显示，许多病毒可将自身蛋白、核酸或完整的病毒颗粒载入外泌体中在细胞间进行传播，在宿主细胞中进行感染和扩散。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、轮状病毒（rotavirus，RV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）等病毒可利用外泌体释放通路完成自身的复制与释放，而病毒感染会导致细胞代谢活动发生改变进而影响外泌体的释放，调控机体的免疫、凋亡、代谢等生理病理过程［26-27］。为了探讨外泌体在DENV中的作用，后续我们将提纯出DENV感染GFP-CD63-BHK-21来源的外泌体，与受体细胞共培养，并将外泌体注射入小鼠进行示踪，研究外泌体在机体内外的摄取和转运机制。由于GFP在体内外示踪的优越性，以及外泌体在病毒感染中起着重要作用，GFP标记的外泌体将可能成为病毒传播机制研究中的有力工具。