静注人免疫球蛋白纯化用层析介质使用寿命的验证

张宝献，刘亚芳，张剑涛，李冠军，李光飞，孙振国，张学成

1.华兰生物工程重庆有限公司研发部，重庆 408102；2.华兰生物工程股份有限公司开发部，河南 新乡 453003

静注人免疫球蛋白是以健康人血浆经低温乙醇法制备的组分Ⅱ沉淀为原料，经Fractogel®EMD TMAE（简称TMAE）阴离子交换层析、纳米膜除病毒过滤、超滤、调制、除菌分装和低pH孵放病毒灭活制备［1］。层析介质的纯化性能直接影响终产品药物的安全性和有效性，层析介质的重复使用可大大降低生产工艺成本，但同时其性能也会随着重复使用次数的增加而降低。层析填料在生物药物纯化过程中属于关键原材料，《中国药典》三部（2020版）中《生物制品生产用原材料及辅料质量控制》将层析填料分为第3级中等风险的原材料，需进行相应的质量控制［2］。近几年来，对层析填料的管理和验证已成为法规监管和现场核查的重点项目之一，《药品生产质量管理规范》中已明确提出需对纯化用材料（如层析柱填料）重复使用的可接受限度进行验证，即层析填料的寿命验证［3］。

本研究在不改变工艺参数的条件下，对静注人免疫球蛋白制备工艺中使用的TMAE层析介质在缩小模型的使用寿命进行界定，通过对离子交换层析洗脱组分中的杂质蛋白分析确定杂质蛋白成分，并进行检测分析，以确保产品具有良好的质量。

1 材料与方法

1.1 静注人免疫球蛋白样品 由华兰生物工程股份有限公司制备。

1.2 主要试剂及仪器Fractogel®EMD TMAE层析介质及层析柱购自德国默克公司；IgA和IgM酶联免疫检测试剂盒购自美国ICL Lab公司；MK3多功能酶标仪和LP Vortex Mixer漩涡振荡器购自芬兰Thermo公司；GENIO电泳仪购自意大利Italy INTERLAB公司；UV-2600型分光光度计和TSKgel 3000SW购自日本岛津公司；AKTA Pure150型层析系统和Severs-900型总有机碳分析仪购自美国GE公司；IX-51型显微镜购自日本奥林巴斯株式会社。

1.3 缩小模型的建立 通用的缩小模型的建立原则是采用线性缩小的方法学［5-9］。依据该线性缩小方法学，1个生产规模的层析柱的线性缩小模型参数见表1。在第1个和每次隔20个循环后，对收集液进行IgA、IgM、分子大小分布检测。在每20个循环后进行N+1次空白试验，空白试验使用与料液性质一致（相同pH，电导）的缓冲液替代料液进行上样，通过层析图谱对比分析是否有紫外吸收峰出现，再生之后继续进行纯化水清洁2～3个层析凝胶体积（column volume，CV），开始取样检测总有机碳（total organic carbon，TOC）。每次空白试验后进行1次柱效检测，并对层析介质运行过程中的层析图谱、蛋白回收率、IgA、gM、分子大小分布、压力、理论塔板数、对称系数和TOC进行趋势分析。对每次层析的参数进行比对，分析随着循环次数的增加关键参数的变化情况，从而确定层析介质使用寿命。层析介质寿命的界定需考察其性能指标随周期延长的变化［10-13］。

表1 生产规模与缩小模型参数Tab.1 Parameters in production scale and downsizing model

1.4 层析流程

1.4.1 层析介质的清洗和消毒 在纯化处理下一批次样品前，用0.5 mol／L氢氧化钠对层析介质进行清洗和消毒，消毒时间30～60 min。

1.4.2 层析介质的平衡和上样 层析上样前，先用层析缓冲液对层析介质进行平衡。平衡完毕后，按照15倍柱体积上样量上样，上样过程中保留时间为20 min。

1.4.3 层析介质的洗脱和再生 样品上样结束后，分别使用3倍柱床体积的洗脱液和再生液对层析介质进行处理，最终保存在20%的乙醇溶液中。

1.5 IgA和IgM含量检测 采用ELISA法，按照试剂盒说明书操作，其中IgA应≤100µg／mL，IgM应≤50µg／mL。

1.6 层析柱清洗效果验证 显微镜观察使用再生和清洁程序是否可去除功能基团上强的吸附物质以及积累的污染物，确定清洁步骤是否有效。

1.7 分子大小分布检测 采用分子排阻高效液相色谱法。测定方法和结果分析按照《中国药典》三部（2020版）通则3122［2］进行，IgG单体和二聚体含量之和应不低于95.0%。

1.8 TOC检测 采用经过校正的仪器进行在线监测，测定方法和结果分析按照《中国药典》四部（2020版）通则0682［4］进行。

1.9 电泳及痕量杂蛋白分析 分别收集离子交换层析后流穿液和洗脱液，采用Protein A特异性吸附层析，进行8%SDS-PAGE，并进行痕量杂蛋白分析。

1.10 层析紫外色谱图叠加对比 选取其中20次循环层析纯化280 nm紫外色谱图进行叠加对比分析，观察层析图谱是否发生明显变异或峰形出现拖尾等恶化现象。

2 结果

2.1 洗脱成分分析 离子交换层析洗脱组分中的杂质蛋白主要有相对分子质量900 000、170 000、100 000、50 000这4个条带，见图1。依据大小推测为IgM、IgA以及一些小分子杂蛋白。

图1洗脱成分的SDS-PAGE非还原电泳图Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE profile of eluate

2.2 层析柱清洗效果验证 显微镜观察显示，凝胶介质使用后，凝胶表面吸附有杂质蛋白；使用洗脱及再生溶液接触层析介质30～60 min，再次观察可见凝胶颗粒表面光滑。见图2。表明使用再生和清洁程序可去除功能基团上强的吸附物质以及积累的污染物，此清洁步骤有效。

图2 层析介质清洗前（A）、后（B）的显微镜观察（×400）Fig.2 Microscopy of chromatographic medium before（A）and after（B）cleaning（×400）

2.3 层析柱缩小模型层析的效果 在240次循环的层析介质寿命验证过程中，IgA检测均值≤100µg／mL，IgM≤50µg／mL，IgG单体与二聚体含量之和＞95.0%，均符合产品质量标准，见表2。

在240次循环的层析介质寿命验证过程中，层析介质对料液中的杂质蛋白保持稳定的去除能力，分离纯化效果未发生衰减。随着层析介质使用次数增加，在层析介质允许的压力报警值以下，层析介质的压力呈逐步升高的趋势，蛋白回收率下降，在可接受范围内。见表2。

每20次循环进行1次理论塔板数和对称系数检测，共进行了12次检测，理论塔板数可达2 000以上，均值为3 196，对称系数均在0.8～1.5范围内，均值为1.13，均在要求范围之内，见表2。表明层析介质可耐受240次静注人免疫球蛋白样品的层析使用。

表2 层析柱缩小模型纯化静注人免疫球蛋白样品的层析效果Tab.2 Purification effect of human immunoglobulin for intravenous injection with chromatographic column in downsizing model

2.4 层析空白对照TOC检测 层析空白对照运行次数21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241的TOC检测结果分别为32.4、53.3、30.4、31.3、34.1、33.8、42.1、45.7、51.1、44.0、33.8、47.0 ppb，均值为39.9 ppb，均小于0.5 mg／L（药典规定纯化水检测标准），表明清洁步骤有效。

2.5 层析紫外色谱图叠加对比20次循环的层析图谱表现出较高的一致性，表明随着层析纯化次数的增多，层析图谱未发生明显变异或峰形出现拖尾等恶化现象，见图3。

图3 层析过程280 nm紫外色谱叠加图Fig.3 UV superposition diagram at 280 nm of chromatographic process

3 讨论

本研究层析介质为TMAE强阴离子交换凝胶，其功能性离子交换集团通过线性聚合物链结合，因此，胶粒具有很高的机械和化学稳定性，可用于分离生化制品、蛋白质、多肽等物质的纯化。根据该特性将杂质蛋白吸附于凝胶上，目标蛋白在流穿液中，实现对静注人免疫球蛋白的纯化。每种层析凝胶的使用寿命应进行独立、专一的研究，建立该层析凝胶使用寿命的研究数据，并在常规商业化生产过程中对该数据进行同步确认。

在建立缩小模型中通常保持层析柱柱高，线性流速不变，降低层析柱的柱直径和体积流速。另外，上样载量、缓冲液体积与柱体积的比值也要保持不变。有时由于硬件原因不能保持柱高和线性流速时，可考虑通过同时改变柱高和线性流速而保持保留时间不变的方案。缩小模型中的前3个循环实验数据与以往的生产数据进行统计学分析，做差异显著性检验，结果无显著性差异，说明缩小模型的建立有效，可代表原生产规模的层析效果和行为。

层析填料的寿命衰减是一个层析性能逐渐退化的过程，并受多种因素的影响：层析介质位于纯化不同阶段、层析模式、介质类型、层析料液的蛋白浓度、上样量和料液中杂质污染过程；所采用的层析介质清洗方案的有效性、其对清洗方案的耐受性及其理化性质；层析介质的储存条件和装填频率等也会影响其使用寿命。因此，需通过系统化的使用寿命研究方案进行数据的收集和分析，从而建立一个合理的使用寿命周期。迄今，已开发了很多方法来提高层析填料的寿命和性能，再生条件优化可有效延长使用寿命，澄清技术的改进改变了原料的性质和后续的层析工艺条件，如流速、流动相黏度等，也可有效延长层析填料的寿命。层析介质的寿命评估必须考虑填料的购置成本、清洗成本、使用次数、验证成本等综合因素决定，越长的寿命，风险越大，验证费用大，并不一定能真正节省成本［14-16］。

层析填料的寿命判断标准主要是层析性能的改变，如动态结合载量的改变、收率的降低以及杂质分离效果的降低等。洗脱收集谱图的变化也可作为一个标准，层析填料的污染往往会导致峰展宽。层析柱的柱效测量标准，如理论塔板数和对称系数也可用来反映层析填料的寿命变化。层析介质的清洗验证与层析介质的寿命对于生物药物的生产十分重要，优化清洗试剂以及清洗的操作程序可延长层析介质的寿命。同时，层析系统的选择（包括层析仪、层析柱以及装柱、层析柱运行的辅助设备）也会影响层析介质的寿命。

本研究对静注人免疫球蛋白层析介质进行了240次循环上样、洗脱和清洗循环后，层析图谱拟合度较好，无多余的杂峰或发生峰的偏移，表现出较高的一致性；制品关键参数IgA、IgM和IgG单体与二聚体含量之和均符合产品质量标准，将静注人免疫球蛋白TMAE层析介质的纯化使用次数暂定为240次。该层析工艺的清洗方法能够有效去除层析过程中结合在层析柱上的杂质成分，使用240次不会对层析介质的分离纯化性能造成影响。缩小规模试验得到的数据仅能证明在层析柱缩小模型的效果，目前使用的TMAE凝胶在商业规模下已使用150次，次数还在不断增加，目前产品质量检测结果稳定且均符合规定，继续使用缩小规模验证TMAE的使用寿命，可为商业规模提供数据支持，降低商业规模中生产的产品质量风险［17-18］。