植物内生菌生物学功能及microRNA 对植物-内生菌互作的影响

薛莲英，杨智宇,2，李天芳，李丽丽

（1. 东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江省酶与类酶工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；3. 黑龙江省林业科学研究所，黑龙江 哈尔滨 150081）

0 引言

植物内生菌是一类能够与植物共生且对植物无明显病害的微生物，其与宿主植物协同进化，并长期处于动态平衡状态中[1−2]。内生菌通常定殖于植物根际或叶际，也可通过种子传播，因其具有促生、抗逆等独特的生物学功能可用于开发生防菌剂[3−5]。此外，内生菌还具有分泌抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性的次生代谢产物[6−8]。因此，内生菌的资源挖掘与利用具有重要的经济价值。

在内生菌-植物的互作机制中，共生相关基因及microRNA 发挥了重要作用。植物microRNA 是一类20~24 nt、与mRNA 具有序列互补性的非编码RNA，通过结合并切割编码区或5′和3′UTR 区的靶基因，抑制靶基因翻译，参与植物细胞中多种信号通路的基因表达和调控，是植物体内重要的“调节剂”[9−10]。

植物内生菌因其独特的生物学功能，是当前研究热点。植物microRNA 在内生菌-植物的互作过程中也发挥了不可替代的作用。本文针对植物内生菌的功能和植物microRNA 对植物-内生菌互作的影响进行综述，为植物内生菌应用到农业、林业和医药行业等提供参考，同时为研究microRNA 在植物与内生 菌互作中的作用机制提供思路。

1 植物内生菌的功能

1.1 植物内生菌的促生作用

植物内生菌对宿主植物的促生作用一般体现在两个方面，一是内生菌分泌促生物质促进植物生长发育，如生长激素和多酚氧化酶等。二是通过溶磷和固氮作用提高植物对土壤养分的利用效率。内生菌具有能够溶解土壤中难溶的磷酸盐、产生铁载体、分泌促生因子（如吲哚乙酸）、降解土壤中复杂的有机分子等作用。IAA 是植物体内最普遍的生长激素，能够促进植物生长、根及果实的生长发育[11]。铁载体能够特异性的螯合Fe3+，使铁元素富集在植物根际，利于植物对铁元素的吸收[12]。

赵晓妍等[13]从野生大豆中分离出一株Providencia属内生细菌-YDX14，发现其可分泌IAA；接种菌株YDX14 后，可显著提高小麦生长量，是潜在的微生物肥料。Ismail 等[14]从菜豆（Phaseolus vulgaris）根中分离出PF2（Alternaria sorghi）、PF3（Penicillium commune）2 株内生真菌，发现2 株内生真菌的代谢产物在增加植物生物量、碳水化合物、蛋白质含量和产量方面明显优于外源激素。一些木霉属真菌也被发现具有重要的促生作用，如哈茨木霉（Trichoderma harzianum）SQR-T037 能够定殖于番茄根部并促进其生长[15]。

上述研究结果表明，内生菌与植物互作能够提高农 作物产量和质量，具有重要的经济价值及发展前景。

1.2 植物内生菌对宿主抗逆性的影响

生物和非生物胁迫是制约植物生长发育的两大影响因素。大量研究发现内生菌能够作为植物的“天然保护剂”，帮助植物抵抗逆境胁迫[16−17]。

植物病害是农业面临的主要难题，在全球范围内，植物病害造成的损失高达16%[18]。传统上一般使用化学药剂防控植物病害，但大量使用化学药剂不但对人类健康及环境产生危害，还会提高病原体抗性[19]。因此，利用生防制剂防控植物病害是近年的研究热点。植物寄生线虫可寄生于多种作物，造成巨大经济损失。此外，由于线虫寄生过程中在植物根部形成创伤，给其他病原体提供了侵染途径[20]。内生菌能够在多种作物和林木中作为生物杀线虫剂被广泛使用，如蔬菜、果树和松树等[21]。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是最经典的昆虫病原真菌之一，在一定条件下也能进入植物体内，促进植物生长并提高宿主植物对病虫害的抗性[22]。蒙怡等[23]发现球孢白僵菌定殖于牛蒡植株后，可促进牛蒡的生长并增强牛蒡的抗性。

当前，干旱、高温、盐碱、重金属胁迫是植物面临的主要非生物胁迫。内生菌能够针对胁迫做出应答，如产生赤霉素和IAA[24−25]，促进植物生长或抵御逆境胁迫；此外，内生菌也能够调节植物产生某些内源性物质来适应逆境胁迫[26]。内生菌可通过促进碳氮代谢和基因表达，减少活性氧损伤，产生植物激素等途径来缓解极端温度对植物的生长影响；通过提高植物解毒酶活性和光合作用，减少活性氧损伤，产生ACC 脱氨酶和渗透调节因子等方式应对盐胁迫；还可通过改变重金属离子的转运和积累来缓解重金属胁迫对植物的危害[27]。

总体来看，内生菌定殖于植物组织内，可能是在环境压力下植物与微生物共进化过程中的一个优化 选择。

1.3 应用植物内生菌修复环境污染

为实现可持续发展，研究人员一直在寻找经济、高效、可行的污染控制技术。近年来，植物修复技术作为一种经济有效的绿色修复技术，已成为水体和土壤净化的研究热点[28]。然而，植物修复还存在植物生长缓慢、生物量小、挥发性污染扩散等问题[29−30]。

网络数据抓取采用大数据理念，强调获取网络大数据，用整体来表征整体，而不是用部分来代表整体，它采取的是普查方式，调查对象的规模、抓取到的数据规模均要比传统抽样调查方法大得多，大数据方法的主要工作由计算机程序自动完成。大数据给社会调查带来的一个重大影响表现为对抽样方法的冲击，“在大数据时代，我们可以分析更多的数据，有时候甚至可以处理和某个特别现象相关的所有数据，而不再依赖于随机抽样”。[6]

人工湿地具有低能耗、低成本、高效能等优点，是当前解决水体污染的有效措施[31]。人工湿地中，植物-内生菌协同作用能够提高工业废水的修复效果，废水中化学需氧量（Chemical oxygen demand，COD）、5 天 内 的 生 化需 氧 量（Biochemical oxygen demand，BOD5）和铬（Cr）的含量分别降低82%、94%和95%，明显优于单独使用植物处理[32]。在植物-内生菌协同作用体系中，内生菌可促进植物生长发育，降低重金属对植物的危害，影响重金属在植物体内的迁移和积累[33]。

植物-内生菌在复合土壤污染修复中的作用机制正逐步被解析[34]。在重金属污染的土壤中，植物-内生菌可通过溶磷作用、产铁载体及植物激素、编码重金属解毒蛋白等方式来降低土壤的重金属污染。对于含有机污染物土壤，植物-内生菌通过减少土壤及植物中污染物含量及毒性、共代谢和酶降解机制对土壤进行修复。Kaneez 等[35]利用植物-内生细菌的协同作用修复原油污染土壤，将3 株内生细菌与双稃草（Leptochloa fusca）和巴拉草（Brachiaria mutica）共 生，其协同作用可显著提高原油的生物降解效率。

1.4 应用植物内生菌提高植物次生代谢产物产量

屠呦呦团队从黄花蒿中提取出青蒿素是植物源药物开发的一个里程碑。尽管化学制药飞速发展，目前仍有较多药用成分来源自植物组织。基于经济利益考虑，人们对一些野生药用植物进行毁灭性采集，使一些药用植物濒临灭绝，如红豆杉。接种内生菌是促进药用植物生长和积累次生代谢产物的重要手段。此外，一些药理活性物质来源自药用植物，研究发现一些内生菌可直接生产这些药理活性物质，因而能够保护这些濒危药用植物物种。

Ye 等[36]从鱼腥草根茎中分离出3 种内生真菌，将其回接到鱼腥草中并共培养后，内生真菌Ilyonectria liriodendra 可促进鱼腥草生长并积累大量酚类物质和挥发物；桔青霉（Penicillium citrinum）能够增加鱼腥草植株的鲜重、总叶面积、株高及根茎生长，但对其代谢产物影响较小，而其中一株未知种属的内生真菌能够促进鱼腥草体内多种药用化合物（如2-十一烷酮和冰片）的积累且不影响宿主植物生长。印度梨形孢（Piriformospora indica）是一种植物根部内生真菌，可定殖于多种植物根部。将姜黄与印度梨形孢共培养，能够显著提高姜黄的次生代谢产物姜黄素的产量[37]。与此类似，丹参内生真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）DF20 能够促进丹参根中丹参酮的生物合成和积累，且在菌株DF20 与丹参共生初期，丹参酮生物合成途径中一些关键酶基因的表达水平会显著增高，后期这些关键酶基因的表达水平 又会有不同程度的下降[38]。

2 植物microRNA 对植物内生菌的影响

研究表明，植物microRNA 具有调节植物生长发育、提高植物对胁迫环境的耐受性等生物学功能[39]。目前，关于植物microRNA 在植物与内生菌互作中作用的相关研究较少。较多研究集中于豆科植物与根瘤菌，植物microRNA 能够影响豆科植物与根瘤菌的共生，可影响内生菌在植物中的定殖，调节植物激素在内共生体系中的表达，调节胁迫环境对植物内共 生体系的影响。

2.1 植物microRNA 对豆科植物-根瘤菌共生的影响

在豆科植物与根瘤菌共生过程中，植物为根瘤菌提供碳源（如苹果酸和琥珀酸）促进其生长及定殖，而根瘤菌通过固氮反应为豆科植物提供氮素营养[40]。近年来，研究人员发现植物microRNA 能够影响豆科植物与根瘤菌共生过程中一些基因和蛋白的变化，并且对根瘤菌在豆科植物中的共生产生影响[41]。

Adnane 等[42]研 究 了 蒺 藜 苜 蓿（Medicago truncatula）与根瘤菌共生过程中miR166 的变化及其功能。结果显示：MIR166 过表达能够减少共生根瘤和侧根的数量，并诱导转基因根中维管束发育模式的改变，且能够对几种HD-ZIP III 转录本的稳定性产生显著性影响。Manish 等[43]解析了鹰嘴豆与鹰嘴豆中慢生根瘤菌（Mesorhizobium ciceri）共生过程中一些microRNA 的功能，发现cat-miR319 通过靶向与生长素诱导基因相互作用的TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF （TCP）来调控生长素信号的转导。

Xu 等[44]研究了在不同氮素水平条件下蒺藜苜蓿中miR169c-GmNFYA-C-GmENOD40 的功能，发现高氮能够诱导miR169c 表达，且其靶基因GmNFYAC 在根瘤菌诱导下在根瘤中优先表达。在miR169c 过表达转基因植株中，miR169c 通过靶向GmNFYAC 的3′-UTR 抑制结瘤，而敲除miR169c 能够促进大豆根部结瘤。此外，GmNFYA-C 的过表达能够促进根瘤菌的定殖和GmENOD40 的表达，促进大豆根部结瘤。

2.2 植物microRNA 功能及其对植物内生真菌定殖的影响

自然条件下，柑橘（Citrus reticulata Blanco）根毛短而稀疏，因而丛枝菌根真菌的定殖对柑橘生长尤为重要，可使柑橘生长量、抗旱性得到提升[46]。接种丛枝菌根真菌后，自柑橘砧木枳（Poncirus trifoliata）中筛选到20 个差异表达的miRNA 和miRNAs菌根真菌的定殖对柑橘生长[47]。筛选内生真菌定殖差异表达microRNA 后，一些研究也通过分析差异表达microRNA 的靶基因来分析其功能，其中 miR399g、miR473、miR1446b/c 和miR477a/c能够靶向丛枝菌根共生的相关基因，如SbtM（Subtilisin-like serine protease）、 RAD1 （Required for arbuscule development 1）和 RFC （Replication factor C）。Isabella 等[48]研究了番茄与厚垣普可尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）内共生过程中microRNA的差异表达，发现一些预测的microRNA 靶基因表达下调， 如miRNA6022 的靶基因Solyc02g087840.2（Homeobox-leucine zipper-like protein, HD-Zip）、Solyc01g005720.2、Solyc01g005730.2（LRR receptor-like serine/ threonine-protein kinase，RLP）和Solyc01g008410.1在番茄根中表达下调； miR156a/b/c 靶基因Solyc07g062980.2 和 Solyc02g077920.2（SQUAMOSA promoter binding protein-like, SBP）在P. chlamydosporia定殖的根中也持续下调。

Piriformospora indica 是一种能够定殖于多种植物的内生真菌。兰花生长缓慢，但与内生真菌共生能够明显促进生长。对P. indica 在文心兰（Oncidium hybridum）根中定殖后microRNA 的差异表达进行分析，发现在P. indica 定殖的文心兰根中，其特异转录组序列与941 个microRNA 家族具有同源性，共筛选到46 个新的microRNAs，其预测的靶基因主要参与生长素信号转导、转录、发育和植物防御[49]。

在植物与丛枝菌根真菌共生初期，植物根系会释放独脚金内酯（Strigolactone），刺激丛枝菌根真菌释放共生因子—Myc-LCOs，为植物与丛枝菌根真菌共生做准备[50−51]。Dominique 等[52]发现了一种由Myc-LCOs 触发的调控机制，可通过microRNA 介导的NSP2 负调控来阻止丛枝菌根真菌对苜蓿根的过度定殖。将靶向NSP2 的microRNA-miR171h 过表达，会抑制真菌定殖；而在miR171h 沉默的NSP2 转基因植株中，真菌的定殖能够增加并延伸到根的伸长区；显示miR171h 介导的NSP2 负调控可将苜蓿根系中的菌根菌定殖控制在一定范围内。

MicroRNA 能够通过调节植物的生长素受体（Auxin receptor）表达来影响丛枝菌根真菌在植物中的定殖[53]。生长素是植物发育中重要的生长调节因子，能够调节细胞伸长、细胞和器官极性。Etemadi等[54]研究了影响生长素受体的microRNA-miR393 在丛枝发育中的作用。结果表明，miR393 能够抑制含丛枝细胞对生长素的感知，是丛枝形成的负调节因子。其中， miR393 前体在番茄（Solanum lycopersicum）、蒺藜苜蓿（M. truncatula）和水稻（Oryza sativa）3 种植物中的表达均下调，miR393 在根组织中的过表达会导致生长素受体基因（TIR1，AFB）表达下调，丛枝发育不足。

以上研究表明，在内生真菌与植物互作过程中，植物microRNA 能够调节菌根共生相关基因以及植物生长必需的调节因子来影响内生菌在植物中的定 殖。

3 小结及展望

当前，较多研究集中于挖掘植物内生菌资源及内生真菌的促生抗逆作用，对植物内生菌的新功能、解析植物-内生菌的互作机制相关研究较少；已有的互作机制研究主要针对内生菌对植物的影响，植物对内生菌影响的相关研究较少。

在豆科植物-根瘤菌体系中，目前已解析了豆科植物-根瘤菌互作的关键基因、microRNA 及其调控网络，有利于调控环境因子促进此共生体系发挥生物学功能。受基因组序列等信息的限制，对于非模式植物、微生物共生互作研究进展较缓慢。此外，自然条件下多种内生菌与植物共生，其互作更为复杂，其互作的分子机制鲜有报道。因而，有必要加强非模式植物、微生物互作及多种内生菌与植物互作中microRNA 的变化及功能研究。

近年来，高通量测序技术及生物信息学技术的发展，有利于解析植物-内生菌互作中的microRNA种类及功能。宏转录组、互作转录组测序技术，既有利于分析植物microRNA 对内生菌定殖的调控，也有利于解析互作过程中内生菌microRNA 表达的变化，可进一步基于过表达及沉默策略分析植物及内生菌microRNA 的功能及其调控网络，从而有利于明晰植物-内生菌的互作机制并进一步调控此共生体系，使其充分发挥生物学功能。