干巴菌菌塘周围云南松幼苗菌根真菌的物种多样性及外部形态*

徐钡昌，甘云浩，罗云生，钟 华，赵 苗，靳博文，段丽华**

（1.昆明市林业和草原科学研究所，云南 昆明 650223；2.宜良县国有花园林场，云南 昆明 652100）

干巴菌（Thelephora ganbajun M.Zang）隶属担子菌门（Basidomycotina）革菌科（Thelephoraceae）革菌属（Thelephora），多生长于滇中海拔800 m～2 200 m的松林中[1]。干巴菌富含多种氨基酸和钾、钙、镁、铁、铜、硒等人体必需元素，其中硒含量3.44 mg·100g-1，为云南常见18种野生食用菌中最高；并具独特香味，深受滇中地区消费者青睐；品质好的干巴菌价格高达1 000元/kg以上[2]。干巴菌是一种与云南松、思茅松、滇油杉等林木有共生关系的外生菌根真菌；而云南松作为我国西南（特别是云南境内）主要的建群树种，其林下外生菌根真菌资源十分丰富；但菌根复杂的营养方式使干巴菌不能脱离共生植物生存，且在其菌种分离过程中杂菌和其他杂质污染严重，难以获得纯菌种；这成为干巴菌尚不能实现人工栽培的主要原因[3-5]。

现今，干巴菌的过度采摘已严重制约其产业发展，为有效保护现有资源，许多研究者通过“包山养菌”来保护干巴菌赖以生存的森林环境，并开展干巴菌原生态微干预促繁措施，探索、提高野生干巴菌的产量及质量[6]。也有研究人员对干巴菌进行了一些遗传多样性分析、菌根形态特征等相关基础研究[1，7]。为进一步深入了解干巴菌生活史，王冉等[8]对两个地区的8朵干巴菌子实体内可培养的细菌进行分离，获得282个菌株，以探讨微生物与菌根真菌之间的相互作用关系。张珊珊等[9]探究了云南松林下干巴菌生长的土壤理化性质和有效态微量元素特征，分析了干巴菌适宜栽培的土壤环境。但要实现干巴菌人工栽培，尚需科研人员开展大量的实践和研究。

由于外生菌根菌需要与特定的宿主植物共生，目前已有研究将块菌[10]、暗褐网柄牛肝菌[11]接种到无菌苗的根部，合成外生菌根苗，进一步生长发育后移栽到野外，从而获得子实体。但如何获取干巴菌菌根苗、实现人工栽培的研究还较少，张光飞等[12]探索了不同栽培基质下干巴菌侵染云南松幼苗形成菌根的条件，为干巴菌人工栽培提供了前期基础。干巴菌菌根苗的培育是实现干巴菌人工栽培的重要途径，因此，探索在自然状态下干巴菌菌丝侵染云南松幼苗形成菌根苗的试验技术，对下一步实现干巴菌人工栽培具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地块设在云南省昆明市宜良县狗街镇小哨社区居委会大狗黑地村，海拔1 760 m，年平均气温16.3℃。试验区以云南松为优势树种，林下夹杂杜鹃和野胡椒，郁闭度约为0.4。土壤为森林红壤，土层深厚肥沃，自然肥力较强。

1.2 云南松播种

1.2.1 种子收集及容器苗培育

云南松种子于2018年12月在宜良县禄丰村林场云南松采种基地采集。

容器苗培育：2019年2月，用水浸泡云南松种子15 min，除去漂浮的空壳种子、虫蛀及异粒种子；用50%多菌灵可湿性粉剂800倍液浸种消毒1 h，消毒后用清水清洗，将冲洗后的种子放入40℃左右温水中浸泡24 h；自然冷却凉干后播种于填满营养土的育苗器（规格为70 mm×70 mm）中，每穴播种2粒；种子出苗后进行间苗，保留长势好的幼苗。云南松幼苗培育期为3个月～5个月。

1.2.2 种植方式

2019年6月，在云南松林内选择干巴菌菌塘80个，分2种方式进行云南松种植。

1）种子穴播：60个菌塘，以菌塘为中心按“米”字形，以10 cm、20 cm、30 cm的间距每穴播种2粒～3粒云南松种子，共计1 440穴。

2）容器苗种植：20个菌塘，以菌塘为中心按“米”字形，以10 cm、20 cm、30 cm的间距种植培育的云南松容器苗，在育苗器面对菌塘方向打16个小圆孔便于菌丝侵入，共计480株。

1.3 菌根采集及处理

1.3.1 菌根的采集

分别于3个时间段进行菌根采集：2019年9月、2020年6月～10月、2021年5月～9月。

采集时以干巴菌菌塘为中心，采用随机取样方式，种子穴播苗以云南松幼苗为半径，用小铁楸取云南松幼苗的根系，寻找侧根；容器苗直接用小铁楸将容器取出后寻找侧根。观察是否有菌根形成；找到菌根用镊子等工具轻剥土壤后用枝剪剪取带有菌根的侧根，再将云南松幼苗种回原位；采集菌根时重点观察菌根及菌丝的形成和分布情况。

1.3.2 样品处理

菌根采集后进行编号、拍照，带回实验室置于4℃冰箱中保鲜待测。采集的样品置于筛子中流水冲洗根部泥土，剪成1 cm根段，于体视显微镜下用镊子、毛刷等进一步清洗。

1.3.3 菌根的形态观察

在体视显微镜下，观察并记录菌根的形状、颜色、分叉等情况。

1.3.4 菌根的分子鉴定

分子鉴定采用内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技术。使用的ITS引物为：

（1）ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′。

（2）ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

委托中科院昆明植物研究所提取菌根rDNA，使用上述引物进行扩增，将rDNA测序后得到的目标序列在NCBI和UNITE数据库中进行Blast分析，得到分子鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 菌塘观察结果

干巴菌菌塘具体的观察结果见图1。

图1 干巴菌菌塘Fig.1 The shiro of Thelephora ganbajun

如图1A所示，以种子穴播的菌塘中，云南松幼苗0～20 cm周围有干巴菌子实体，可观察到干巴菌子实体经发育后将云南松幼苗主杆包围的现象。

如图1B所示，以容器育苗的菌塘中，仅有1个种植点有干巴菌子实体出现在容器中。采用容器育苗主要便于菌根的观察、采集以及今后移栽；由于未检测到干巴菌菌根，无法对种子穴播和容器育苗2种种植方式进行比较，但在采集完菌根后重新种植时发现，容器苗重新种植的成活率明显高于种子穴播苗的成活率。

如图1C所示，在原松林中云南松的菌塘中，据干巴菌子实体水平位置15 cm～20 cm、土壤深度2 cm～10 cm，均有许多肉眼可见的黑褐色老化菌根和黄白色新生菌根，新生菌根与老化菌根通常两者交织、成片聚集。对观察全部结果进行总结发现，部分菌塘中采集干巴菌子实体时，其基部紧紧依附在已木栓化或干枯甚至死亡的云南松侧根上，侧根上有二叉分支结构的黑褐色老化菌根和黄白色菌根，黑褐色老化菌根易碎，部分子实体基部未见有菌根或菌根长在子实体中。

2.2 不同类型种类菌根外部形态特征和分子鉴定

2019年～2021年共采集到菌根样品183个，经体视显微镜初步筛选后对其中48株菌根大型真菌进行rDNA ITS测序及比对，结果显示确定到种水平的有10种，分别为血红菇（Russula sanguinea），鲜艳乳菇（Lactarius vividus），刺孢拟小垫革菌（Tomentellopsis echinospora）， Russula brevipileocystidiata，西伯利亚乳牛肝菌（Suillus sibiricus），轴腹菌（Hydnangium carneum），黄褐乳菇（Lactarius cinnamomeus），小豹斑鹅膏（Amanita parvipantherina），变黑根须腹菌（Rhizopogon nigrescens），辛德锁瑚菌（Clavulina thinadii）；确定到属水平的有3种，分别属于红菇属（Russula），长毛盘菌属（Trichophaea），棉革菌属（Tomentella）；确定到科水平的有3种，分别属于阿太菌科（Atheliaceae），火丝菌科（Pyronemataceae），革菌科（Thelephoraceae）。其中以红菇属最多，未检测出干巴菌菌根。

对采集到的菌根样品进行体视显微镜宏观形态观察，其中16种不同的大型真菌共生外生菌根形态特征见图2。

如图2所示，16种不同的大型真菌共生菌根的外部形态特征分别如下。

图2 16种大型真菌共生的云南松幼苗外生菌根外部形态Fig.2 Ectomycorrhizal morphology of Pinus yunnanensis seedlings symbiotic with 16 macrofungi

1）血红菇：菌根为黄棕色，单轴分支，外延菌丝少量。

2）红菇属菌株：菌根为亮黄色，单轴分支，外延菌丝少量。

3）阿太菌科菌株：菌根为亮黄色，不分支或二叉状，表面吸附有少量土壤颗粒，外延菌丝少量。

4）鲜艳乳菇：菌根为黄白色，二叉状多次分支，有少量外延菌丝

5）刺孢拟小垫革菌：菌根为黄棕色，二叉分支，菌根表面光滑。

6）小豹斑鹅膏：菌根为黄白色或浅黄绿色，棒状或二叉分支，外延菌丝较少。

7）变黑根须腹菌：菌根为棕黄色，簇状，菌根表面有棉絮状米白色菌丝包裹。

8）Russula brevipileocystidiata：菌根为黄白色，棒状不分支或单轴分支，有少量外延菌丝。

9）长毛盘菌属菌株：菌根为黑褐色，二叉分支，表面灰白色外延菌丝少量。

10）西伯利亚乳牛肝菌：菌根为褐色，单轴分支，表面有大量灰白色外延菌丝并吸附有土壤颗粒。

11）轴腹菌：菌根为黑褐色，不规则分支。

12）棉革菌属菌株：菌根为黑褐色，二叉分支，表面有大量灰白色外延菌丝。

13）火丝菌科菌株：菌根为黑褐色，不分支或二叉分支，外延菌丝少量。

14）黄褐乳菇：菌根为亮黄色或黄白色，二叉分支，有少量外延菌丝并吸附有土壤颗粒。

15）革菌科菌株：菌根为褐色，不规则分支或塔状分支，有大量灰白色外延菌丝。

16）辛德锁瑚菌：菌根为黄褐色，不规则单轴塔状，表面有较多灰白色外延菌丝。

3 讨论与结论

干巴菌与云南松有着密切的共生关系，因此选择在干巴菌菌塘播种云南松幼苗，观察形成的菌根情况，这对实现干巴菌人工栽培有重要意义。在菌塘中可以清晰地观察到大量的菌根聚集在云南松侧根上，有的菌根被菌丝缠绕。菌根的颜色、分叉类型是初步判断不同类型外生菌根最直观的形态特征，但这些特征会受到宿主植物、外部环境等诸多因素的影响，也需要对菌根与共生植物之间的特殊作用进一步开展研究。

研究结果发现，干巴菌菌塘自然侵染的云南松幼苗中红菇属菌根是主要的菌根类型，形成菌根的概率最高，为14.58%；其次为乳菇属菌根，概率为10.42%。这与前人研究结果一致，如谢雪丹等[5]在云南松林幼苗上发现红菇类真菌菌根是主要菌根类型。有研究者发现棉革菌真菌是云南松幼苗主要的共生菌根真菌[13]，但在此次研究中仅发现棉革菌属真菌1例。总体来看，菌塘附近松林的云南松树龄为30年以上，新播种的云南松树林为5年以下，经分子鉴定外生菌根真菌多样性较高，共16种不同的大型真菌；云南松林下外生菌根真菌的发生与分布受气候、植被、地形、土壤条件和人为干扰等诸多因素影响[14]，其中林龄和近两年降水减少是影响本研究中外生菌根种类和组成的重要因素；通过鉴定未发现干巴菌菌根，这可能与干巴菌菌丝发育及形成菌根的数量较少，并未形成优势菌根有很大关系，后续需要进一步探索影响干巴菌菌根形成及发育的因素以获得干巴菌菌根苗。