免疫检查点在皮肤肿瘤中的研究进展

刘亭亭 刘 红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院)，山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022

皮肤肿瘤是原发于皮肤或其附属器的肿瘤或由其他内脏器官、组织的恶性肿瘤转移到皮肤的转移瘤。皮肤肿瘤是现在比较难以治疗的皮肤科疾病，主要包括黑素瘤(melanoma)、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma, CTCL)、基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)和皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC)等。皮肤肿瘤的发病率与T细胞的免疫抑制呈正相关性，CD4+T或CD8+T细胞的免疫抑制会增加个体罹患cSCC[1]、BCC[2]、MCC[3，4]、Kaposi肉瘤[5]和恶性黑素瘤[5]的风险。这既反映了肿瘤的免疫原性，也揭示了T细胞对监测和控制肿瘤发生的重要性[6]。

鉴于T细胞功能缺陷与皮肤肿瘤发生的相关性，多种调节T细胞的免疫疗法已被应用于皮肤肿瘤的治疗，如Ⅰ型干扰素疗法和白介素2(IL-2)疗法。I型干扰素具有多种功能，不仅能激活T细胞，还能增强肿瘤固有抗原的提呈，目前已被应用于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肝癌等疾病的治疗[7]。然而Ⅰ型IFN特别是IFN-α2b，特异性较弱，单独使用时效果不显著且不良反应明显，短期不良反应导致疲劳、发热、寒颤、头痛和恶心等症状，长期不良反应导致较为严重的肾毒性、肝毒性、内分泌紊乱等[7]。IL-2是一种细胞因子，可以促进T细胞和自然杀伤(natural killer，NK)细胞的扩增。尽管IL-2能够通过扩增CD8+T效应细胞来提高免疫反应，它也会促进调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)扩增来抑制效应T细胞对肿瘤的杀伤效应[8]。因此，传统的免疫疗法如Ⅰ型干扰素和IL-2对于皮肤肿瘤的治疗并未获得显著疗效。

近年来多项研究发现，黑素瘤、CTCL、cSCC、BCC和MCC等皮肤肿瘤患者T细胞高表达多种免疫抑制受体，新兴免疫疗法通过阻断免疫抑制受体可以显著提高患者的中位生存期和客观缓解率[9，10]。免疫抑制性受体也被称为免疫检查点，是一类免疫抑制性分子，其高表达可使T细胞发生耗竭，效应功能丧失，从而减少对肿瘤细胞的免疫监视及杀伤作用，导致肿瘤细胞发生免疫逃逸[11，12]。目前，研究最为广泛的免疫检查点为细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen, CTLA-4)、程序性死亡受体1(programmed death 1, PD-1)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3, TIM-3)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域(T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain, TIGIT)、淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)[11，13]。2018年James P Allison和Tasuku Honjo因分别发现CTLA-4和PD-1及PD-L1而被授予诺贝尔生理学或医学奖，这也使得近年来免疫检查点相关的研究备受关注。

CTLA-4是第一个临床靶向的免疫检查点[14]，它在T细胞上表达，与CD28共享相同的配体(CD80和CD86)，主要调节T细胞激活的早期阶段。PD-1在T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞及NK细胞表面表达，其配体是PD-L1和PD-L2[15]。TIM-3在CD4+Th1、CD8+Tc1、Th17、Treg、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞(Dendrtic cell, DC)表达[13，16]，其配体是Galectin-9(Gal-9)、CEACAM1、PtdSer和HMGB1[17]。TIGIT在T细胞、NK细胞和Treg细胞中特异性表达[18，19]，TIGIT和CD226共享同一组配体，CD155和CD112。LAG-3主要在T细胞、B细胞、DC细胞和NK细胞中表达[20]，其配体是MHC-Ⅱ类分子、galectin-3、LSECtin和α-synuclein等。

免疫检查点与其相应受体的相互作用的机制为：T细胞表面表达CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等免疫检查点，抗原递呈细胞(antigen presentation cells, APC)表面表达各种免疫检查点的受体如CD80/CD86、PD-L1/PD-L2、galectin9、CD155/CD112和MHCII，免疫检查点与其相应受体结合会直接抑制效应T细胞的活性；另一方面，高表达免疫检查点的Treg细胞会通过分泌IL-10间接抑制效应T细胞的活性。

1 免疫检查点在皮肤肿瘤中的研究进展

免疫检查点是免疫系统的抑制性调节分子，参与维持机体自身抗原的免疫耐受，通过与相应配体的相互作用，调节靶细胞的功能状态，在肿瘤中发挥重要的免疫调控功能。

1.1 黑素瘤 在黑素瘤患者中，T细胞CTLA-4的表达水平升高，并伴随着MIP-1β、TNF-α和IFN-γ分泌的减少[21]；Treg细胞CTLA-4表达上调并分泌更多的IL-10[22]。Chapon等[23]的研究发现，在原发性黑素瘤肿瘤浸润的CD4+T和CD8+T细胞高表达PD-1；并且在已转移的晚期皮肤癌组织中，PD-1的表达水平进一步升高；分离肿瘤浸润T细胞，体外刺激后产生的IFN-γ减少。在晚期黑素瘤患者中，约有30%的CD8+T细胞共表达PD-1和TIM-3；且与TIM-3-PD-1+细胞相比，TIM-3+PD-1+亚群表现出更加失能的表型，产生的TNF-α、IFN-γ和IL-2进一步减少[24]。Chauvin等[25]发现，黑素瘤患者肿瘤抗原特异性CD8+T细胞和肿瘤浸润的CD8+T中，TIGIT表达均上调，并且TIGIT的高表达往往伴随着PD-1水平的升高；同时阻断TIGIT和PD-1可增加CD8+T细胞的增殖、细胞因子的产生和颗粒酶的分泌。在B16F10细胞诱导小鼠黑素瘤模型中，Tregs细胞高表达TIGIT且分泌的IL-10显著升高，其中约有60%的TIGIT+Tregs细胞共表达TIM-3并呈现更强的抑制功能[26]。Xu等[27]报道，在表达LSECtin(LAG-3配体)的黑素瘤细胞存在的情况下，LAG-3会抑制T细胞IFN-γ的产生；在黑素瘤患者的外周血和肿瘤组织中，LAG-3在Treg细胞上高表达，并通过产生高水平的IL-10和TGF-β，抑制肿瘤特异性T细胞的效应[28]。

1.2 皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma, CTCL) 蕈样肉芽肿(Mycosis fungoides, MF)和Sézary综合征(Sézary syndrome, SS)是两种最常见的CTCLs。免疫组化分析15例限制性斑块期MF、15例泛发性肿瘤期MF和11例SS患者皮损，发现PD-1的阳性率分别为40%(6/15)、60%(9/15)和73%(8/11)，41例CTCL总阳性率为56%；同时，在5例SS患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中也检测到PD-1在CD4+T细胞中的高表达[29]。Cetinozman等[30]比较了皮损T细胞表达PD-1的比例超过50%的样本，SS患者为89%(24/27)，而MF患者为13%(8/60)，结果显示PD-1在SS和MF之间的表达存在差异。与红皮病型炎症性皮肤病(12例自发性、10例特异性、6例银屑病和2例副肿瘤)相比，25例SS患者中有23例(92%)超过50%的浸润T细胞表达PD-1，而红皮病型炎症性皮肤病只有4例(13%)；SS中PD-1主要是在肿瘤CD4+T细胞表达，而红皮病型炎症性皮肤病PD-1主要在真皮和表皮CD8+T细胞表达[31]。除了PD-1外，CTCL患者也高表达其它免疫抑制性受体如CTLA-4和LAG-3：与健康皮肤相比，CTCL患者皮损中CD4+T细胞高表达PD-1、CTLA-4和LAG-3，CD8+T细胞高表达CTLA-4和LAG-3；同样地，通过对CTCL患者皮损样本进行mRNA表达谱分析发现，与T1/T2期患者相比，T3/T4晚期患者样本免疫检查点相关的mRNA表达上调[32]。

1.3 基底细胞癌(basal cell carcinoma, BCC)和皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC) 在40例BCC患者肿瘤微环境中，9例(22%)肿瘤细胞表达PD-L1，33例(82%)肿瘤浸润淋巴细胞和巨噬细胞表达PD-L1；40例(100%)肿瘤浸润淋巴细胞表达PD-1；且肿瘤或巨噬细胞上PD-L1的表达与淋巴细胞上PD-1的表达呈现正相关性[33]。来源于62例BCC患者的138个肿瘤组织样本中，124例(89.9%)肿瘤细胞中PD-L1表达呈阳性，131例(94.9%)肿瘤浸润淋巴细胞PD-L1表达呈阳性[34]。在61例cSCC患者肿瘤微环境中，25例(41%)PD-L1呈阳性，37例(61%)PD-L2呈阳性，利用CD1a和CD83分别标记未成熟和成熟的DC，发现cSCC患者肿瘤组织CD1a+未成熟DC 中PD-L1和PD-L2的表达明显高于CD83+成熟DC；PD-L1的表达率与肿瘤等级相关，而PD-L2的表达率与cSCC分化和肿瘤大小相关[35]。比较40例原发性和5例转移性cSCC患者发现，20例低转移风险的患者中有4例(20%)表达PD-L1，20例高转移风险的患者中有14例(70%)表达PD-L1，而转移性患者5例(100%)均表达PD-L1，表明PD-L1的表达水平与肿瘤转移风险呈正相关性[36]。

1.4 默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC) MCC患者外周血CD8+T细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞中高表达PD-1和TIM-3,其中90%TIM-3+T细胞共表达PD-1；在整个疾病过程中，CD8+T细胞一直表达高水平的PD-1；肿瘤组织中PD-L1的表达与肿瘤浸润的CD8+T细胞呈正相关性[37]。MCC患者肿瘤浸润T细胞低表达活化标记物CD69和CD25，却高表达耗竭标记物PD-1；同时DC和巨噬细胞的PD-L1和PD-L2表达也上调[38]。总之，大约42%～49%的癌细胞、55%肿瘤浸润细胞和39%的瘤周巨噬细胞高表达PD-L1；肿瘤细胞表达PD-L1的患者均存在中等或高度淋巴细胞浸润；而PD-L1和PD-1表达水平与年龄、性别和初始诊断均不相关[39,40]。这些结果表明，PD-1/PD-L1信号是MCC治疗的潜在靶标。

综上，在各种皮肤肿瘤微环境中，CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等免疫检查点高表达：一方面，在T细胞中高表达，可以竞争性的抑制共刺激因子对T细胞的活化，直接诱导效应T细胞的耗竭；另一方面在Treg中高表达，增强Treg细胞的免疫抑制功能，间接性的诱导效应T细胞的失能。

2 免疫检查点抑制剂在皮肤肿瘤的临床应用

基于免疫检查点在肿瘤中的作用机制，近年来，免疫检查点抑制剂已成为治疗肿瘤的热点，通过阻断免疫检查点，激发自身免疫反应，在实体肿瘤中成效显著，能够明显改善患者的预后。因此，详细探讨不同肿瘤微环境条件下免疫检查点的生物学效应将为肿瘤免疫干预提供新的思路。靶向CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗体已经广泛应用于黑素瘤、CTCL、MCC和BCC的治疗。

2.1 CTLA-4 CTLA-4单抗与CTLA-4结合后可阻断CTLA-4与CD80/CD86的相互作用，进而阻断抑制性信号向T细胞的传递，从而刺激T细胞的免疫应答[12]。经过长达10年的临床试验后，2011年3月，第一个T细胞靶向抗体CTLA-4单抗ipilimumab，被批准用于治疗不可切除或转移性黑素瘤患者。比较ipilimumab和糖蛋白治疗晚期黑素瘤患者的临床数据，中位生存期分别为10.1个月和6.4个月，治疗12个月的总生存率分别为45.6%和25.3%，18个月为33.2%和16.3%，24个月为23.5%和13.7%[9]。MF患者经过三次ipilimumab治疗后，所有皮肤MF病变消失[41]；SS患者接受ipilimumab治疗后，也表现出显著的临床反应，包括红斑减少50%，皮肤和皮下肿瘤大小减少75%，小腿溃疡减少50%，瘙痒程度减弱，正常生活活动得以恢复[42]。鉴于作为可切除MCC辅助治疗方案的效果不佳，ipilimumab用来治疗MCC的案例比较少见[43]。

尽管与化疗和传统免疫疗法相比，ipilimumab可以提高患者的中位生存期和客观缓解率，与PD-1/PD-L1靶向治疗相比，CTLA-4单抗面临两个挑战：疗效不佳和毒性较强[44]。Weber等[45]比较nivolumab(PD-1单抗)和ipilimumab在906例晚期黑素瘤的疗效：nivolumab治疗患者一年无复发生存概率为70.5%，而ipilimumab为60.5%；nivolumab治疗患者中有14.4%报道了严重免疫治疗相关不良事件，而ipilimumab则为46.2%；由于严重的毒性，9.7%的nivolumab治疗患者和42.6%的ipilimumab治疗患者会停止治疗。Larkin等[46]的临床试验发现，对于晚期黑素瘤患者，nivolumab治疗平均生存36.9个月，而ipilimumab只有19.9个月。此外，尽管抗PD-1治疗已被批准用于黑素瘤、肺癌、肝癌、肾癌和淋巴瘤等，抗CTLA-4治疗在很大程度上依然只局限于黑素瘤[47]。

尽管ipilimumab单药治疗存在这些问题，Tawbi等发现ipilimumab与nivolumab联合治疗可以进一步改善抗PD-1抗体的治疗反应，如提高总生存期、客观缓解率和无进展生存期时间等，因此临床上推荐联合使用ipilimumab和nivolumab进行黑素瘤等的治疗[46,48]。

2.2 PD-1 PD-1和PD-L1抑制剂可阻断PD-1/PD-L1的相互作用，激活T细胞，减少肿瘤微环境中免疫抑制成分，从而达到抗肿瘤的目的[49]。2014年，美国食品药品监督管理局批准了首个抗PD-1单克隆抗体nivolumab，用于不可切除或转移性黑素瘤的二线治疗[50]。此后，多种抗PD-1抗体(pembrolizumab, cemiplimab)和抗PD-L1抗体(atezolizumab, avelumab, durvalumab)也陆续用于癌症治疗[51]。自PD-1/PDL-1阻断药物上市以来，临床获益最大的是黑素瘤患者。例如，在晚期转移性黑素瘤的治疗中，pembrolizumab单抗能在诱发最小毒性的条件下提高患者的总体生存期，与ipilimumab治疗组相比，pembrolizumab单抗将12个月总生存率从58.2%提升至74.1%，而不良反应率则从19.9%降至10.1%[10]。目前，这些PD-1/PDL-1靶向药物已被用于黑素瘤的一线治疗[50,52]。在晚期BCC病人中，9例患者接受pembrolizumab单药治疗，9例患者使用pembrolizumab和维莫德吉联合治疗，18周时客观缓解率分别为44%和29%，一年内无进展生存率为 62%和83%[53]。对于晚期cSCC，抗PD-1药物cemiplimab的客观缓解率为47%[54]；对于MCC，pembrolizumab[55]和avelumab[56]的客观缓解率分别为56%和62%，这些药物也可以显著提高患者的总生存率。

与其它免疫疗法相比，在CTLA-4单抗ipilimumab难以治愈的黑素瘤中，PD-1阻断剂pembrolizumab可以发挥很好的疗效[57,58]；PD-1阻断剂诱发的毒性显著小于IL-2治疗和CTLA-4单抗治疗[52]。与其他癌症疗法(包括辐射、化疗和手术)相比，尽管PD-1/PD-L1阻断药物也会出现不良事件和复发等，其治疗机制在于靶向目标细胞，所以更为安全[15,59]。

2.3 TIM-3 尽管在临床前小鼠模型中，单独抑制TIM-3往往对肿瘤生长影响甚微，而2010年Sakuishi等[60]在结肠癌小鼠模型中发现，肿瘤浸润CD8+T细胞高表达TIM-3，且几乎所有TIM-3+浸润淋巴细胞均共表达PD-1，TIM-3+PD-1+细胞表现出最严重的耗竭表型，无法产生IL-2、TNF和IFN-γ，PD-1和TIM-3联合靶向治疗可显著降低肿瘤生长，效果优于任一单药靶向治疗。

大量临床前数据表明联合阻断PD-1/TIM-3会增强肿瘤抗原特异性T细胞反应并促进肿瘤消退。基于这些发现，一些以TIM-3为靶点的抗体正在进行临床试验。TSR-022是一种人源化抗TIM-3 IgG4抗体，于2016年进入I期临床试验(NCT02817633)旨在评估TSR-022作为单药或联合TSR-042(抗PD-1单抗)治疗晚期实体瘤患者的安全性和有效性，初步发现高剂量联合治疗组的临床疗效其总缓解率为15%，病情稳定率为40%[61,62]。MBG453是另一种抗TIM-3单抗，目前多项临床试验也在评估MBG453作为单药或与PDR001(抗PD-1单抗)联合治疗晚期恶性肿瘤患者的安全性和有效性[63]。

2.4 TIGIT 越来越多的临床前数据表明，PD-1/TIGIT共同阻断是一种潜在的联合免疫治疗方案。在小鼠结肠癌肿瘤模型中，尽管单独阻断TIGIT或PD-1/PD-L1均不能抑制肿瘤的生长，但共同阻断TIGIT和PD-1/PD-L1可协同性地增强CD8+T细胞的活性，并延长总生存期[64]。在黑素瘤患者中，与单一阻断相比，PD-1/TIGIT双阻断会增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的功能[25,65]。

基于以上的研究成果，已经有多种TIGIT抗体研发进入临床试验阶段，其中tiragolumab是目前最有潜质的药物。在一项随机、双盲的II期临床试验中(NCT03563716)，135例未治疗的、不可切除、转移性的、PD-L1阳性的非小细胞肺癌患者分别利用tiragolumab单独治疗，或者联合atezolizumab(抗PD-L1抗体)治疗，结果显示，联合用药组表现出了更高的客观缓解率和无进展生存期[62]。tiragolumab用于治疗食管癌和胃癌的I期和II期临床试验也在进行中(NCT03281369)。此外，还有多家制药公司投入抗TIGIT药物的研发，如Vibostolimab(MK-7694)、Domvanalimab(AB154)和BMS-986207等，这些药物目前还处于初步评价的I/II期临床试验阶段[62]。

2.5 LAG-3 阻断LAG-3可在多种癌症小鼠模型中恢复CD8+T细胞的活性并降低Treg细胞的抑制功能。鉴于多种肿瘤浸润T细胞中共表达LAG-3和PD-1，LAG-3/PD-1双阻断的联合治疗会进一步增强抗癌疗效：在一些临床前的小鼠癌症模型中，LAG-3和PD-1在CD4+和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞上共表达，联合阻断可以协同改善T细胞的抗肿瘤反应[66]；在卵巢癌病人中，CD8+T细胞高表达LAG-3和PD-1，共同阻断会促进肿瘤特异性CD8+T细胞的增殖和细胞因子的产生[67]。

目前，临床试验正在探索由LAG-3驱动的免疫应答。多个早期临床试验也正在测试单独靶向LAG-3或者联合阻断PD-1和/或CTLA-4的治疗效果。在I期的临床试验中，可溶性的LAG-3-Ig(IMP321)治疗晚期肾细胞癌[68]和晚期胰腺癌(与化疗联合治疗)[69]的研究表明，高剂量的IMP321能抑制肿瘤的生长。IMP321联合pembrolizumab(抗PD-1抗体)治疗非小细胞肺癌和头颈部鳞状细胞癌的临床试验也在进行中。另一种靶向LAG-3的药物Relatlimab(BMS-986016)作为一线或二线治疗的治疗方案，在多种肿瘤中进行临床试验：如单独或联合nivolumab治疗转移性黑素瘤的II/III期试验和联合nivolumab和化疗治疗胃癌的II期试验[62]。

因此，靶向免疫检查点的免疫疗法，如临床上已经广泛使用的靶向CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗体，可以阻断T细胞的耗竭，并使其发挥抗肿瘤的作用，已取得了显著的疗效。这也使得靶向TIM-3、TIGIT和LAG-3的临床应用研究成为关注的焦点，未来需要更多的免疫治疗临床试验来探索单药或与联合用药对肿瘤的作用，以期更好地改善患者的临床症状。

3 小结

免疫检查点(CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等)表达于免疫细胞表面，与肿瘤的增殖、侵袭、转移及患者预后评估紧密相关，是良好的肿瘤治疗靶点。鉴于其在肿瘤微环境中的高表达，抗CTLA-4、PD-1/PDL-1抗体的单药治疗或联合治疗已广泛应用于黑素瘤、默克尔细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、基底细胞癌和皮肤鳞状细胞癌等皮肤肿瘤的临床治疗。靶向新兴的免疫检查点(TIM-3、TIGIT和LAG-3)的临床试验也表现出了良好的潜能，在未来可能会为皮肤肿瘤患者提供更优的治疗方案。