脂溢性角化病造模方法研究进展

李佳惠 马 枞 佟 立

内蒙古民族大学附属医院，通辽，028000

脂溢性角化病(seborrheic keratosis，SK)又称为基底细胞乳头瘤、老年斑，是常见的皮肤良性肿瘤，国内研究显示SK发病年龄高峰为51～79岁[1]。SK可以发生于除黏膜、手掌和足底之外的任何皮肤部位[2]。目前认为SK发病的危险因素包括紫外线暴露、年龄、免疫异常等[3]。随着人们对皮肤健康重视程度的提高，脂溢性角化病在皮肤科门诊越来越常见。目前常用的治疗方案为液氮冷冻、激光和手术等，费用较高，且如果后续护理不当可能出现炎症后色素沉着[3]。

鉴于SK的具体发病机制尚不明确，治疗方式局限，因此建立重复性高、稳定性好的SK模型对深入研究病因、发病机制、治疗及有效预防具有重要意义。目前SK模型可分为动物模型和细胞模型，研究者大多从SK机制出发或在研究相关疾病中发现SK皮损。本文就目前国内外SK模型建立的进展进行综述，并对每种造模方法进行评价，以期为模型选择提供依据。

1 动物模型

1.1 基因工程SK小鼠模型 基因工程动物模型是近年来常用的造模方法，通过导入外源目的基因或基因敲除的方式进行造模。一般只涉及单个基因。

1.1.1 成纤维细胞生长因子受体3突变的小鼠模型 成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3)是酪氨酸激酶受体(FGFR1-4)中的一种，参与调控细胞生长、分化、迁移，伤口愈合和血管生成的信号转导[4]。FGFR3突变是SK中最常见的致癌基因突变[5]。2005年Logié等[4]在对FGFR3致癌作用的研究中，构建携带S249C位点突变的FGFR3载体，再将此载体注射到B6D2F1小鼠的受精卵中。随后出生的7只小鼠中有4只在皮肤上表达了突变的FGFR3基因，3只出现了皮肤表型，这3只小鼠的后代也遗传了突变基因并且在3～4个月龄时眼睑、鼻部出现疣状肿瘤，后续出现躯干部皮肤增厚并伴有毛发脱落。皮损的组织学检查与脂溢性角化病相似。

该研究是首次在FGFR3突变的转基因实验研究中发现SK皮损，证实了FGFR3突变与SK发病的关系，并为酪氨酸激酶靶向药物治疗提供可能性。然而，FGFR3突变是否能直接诱导SK发病尚存争议。有研究者通过靶向基因重组方法构建FGFR3突变的小鼠用于研究软骨发育不全[6]，在这些小鼠中并没有出现皮肤病变，研究者推测该突变可能受到小鼠遗传背景、FGFR3在皮肤表达的数量以及FGFR3突变的启动子在小鼠和人类之间存在差异的影响[4]。还有研究者认为FGFR3的突变可以导致皮肤增生，但不足以导致皮肤的良性或恶性肿瘤[7]。这些研究说明该方法直接诱导小鼠出现SK存在不稳定性，FGFR3突变与SK发病之间可能存在其他推动因素。因此该方法建立SK模型在理论和实践上还需要继续的讨论。值得关注的是，FGFR3突变激活下游叉头框蛋白1可能与SK保持良性增殖和凋亡抑制有关[8]。研究者可以以此为思路继续探究致癌基因FGFR3突变与SK发病以及保持肿瘤良性性状之间的关系。

1.1.2 早老蛋白1部分缺失的小鼠模型 早老蛋白(presenilins ,PSs)是γ-分泌酶复合体的活性中心，参与切割淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)羧基末端片段，与年龄相关疾病阿尔兹海默症的发病有关[9]。其中早老蛋白1(presenilin1，PS1)在γ-分泌酶复合体相关途径中占主导作用[10]。2004年Tournoy等[11]研究PSs功能受损的后果，同时为了避免全部敲除PSs基因型PS1/PS2-的胚胎致死性，故部分敲除PS1基因得到PS1+/-PS2-/-基因型的小鼠，具体方法不详，结果观察到75%(25/33)的小鼠在6～18个月龄时生殖器周和口周出现疣状突起和皮肤糜烂，主要位于生殖器周和口周，经过组织学检查与人类的SK极为相似。有的小鼠还出现了不同程度的颈部肿胀等免疫异常表现。

这次研究首次证明了SK的发病与PS1部分缺失存在联系，也提出了与年龄相关的发病因素。2018年，有研究发现PS1的下游蛋白APP在SK皮损中表达高于正常皮肤，尤其见于紫外线暴露部位[12]。2021年牟婧淳等[9]等研究发现PS1的mRNA水平在SK皮损中明显低于邻近正常皮肤组织(P<0.001)，再次证实了PS1以及APP与SK发病相关。2014年Watanabe等[13]在研究早老蛋白部分缺失对大脑皮层神经元活动的影响时，条件性敲除PS1得到不同程度的PS2小鼠，研究者没有阐明小鼠皮肤的病变，因此PS1的部分缺失似乎与SK的发病关系更大。但是由于此后并没有学者重复该方法研究SK，因此该方法造模仍存在偶然性，研究者可根据此思路设计模型，探究PS1和SK发病的具体机制，进一步提高模型的稳定性。

1.2 紫外线诱发SK小鼠模型 与人类相关的紫外线(Ultraviolet，UV)由长波紫外线UVA和中波紫外线UVB组成[14]。目前UVA、UVB均有诱导出SK的相关报道。

1.2.1 UVA照射诱导SK小鼠模型 2011年Ming等人[15]利用15 J/cm2的UVA照射抑癌基因PTEN下调的小鼠来研究PTEN在UVA诱导的皮肤肿瘤中发挥的作用。37周时PTEN+/-小鼠出现了皮肤肿瘤，其中67%的皮肤肿瘤为SK，33%为鳞状细胞癌。此方法诱导的SK小鼠可进一步用于病因机制方面的研究，但是由于同时出现了鳞状细胞癌小鼠，说明此方法的结果存在不确定性，或许与小鼠在实验中很难接受相同紫外线照射时间有关，而且此方法实验周期长，操作较复杂，不适合大量复制和进行短期内研究。

1.2.2 UVB照射诱导SK小鼠模型 2009年，Haw[16]等利用UVB照射12周龄的无毛白化Skh：HR-1小鼠来研究聚谷氨酸(γ-PGA)的抗肿瘤作用，12周后发现小鼠皮损中最常见的皮肤病变为脂溢性角化病。这是首次对UVB诱导出SK进行报道的文章。但是研究者在文献中没有明确UVB的照射剂量及时间，因此实验缺乏可重复性。2012年Saeed等[17]为研究UVB照射对小鼠表皮中的表皮生长因子受体(EGFR)的影响，利用波长为312 nm的UVB照射4周龄BALB/c小鼠，暴露组照射20 min/天，每周5天，共3个月。3个月后在暴露组小鼠皮损的病理检查中发现了常见的棘皮型SK，同时发现暴露组小鼠表皮的EGFR表达明显升高。这次研究再次说明UVB照射可以成功诱导脂溢性角化病，并且明确了UVB的辐照剂量和辐照时间，探索了SK相关的发病机制，还证实了抗氧化剂有减缓SK发病的作用。2016年Saeed等[18]再次利用UVB照射3～4周龄BALB/c小鼠(方法同上)，来研究防晒霜对SK的预防作用。这次在暴露组中又一次成功诱导出SK小鼠。

以上研究说明长期慢性UVB照射诱导SK小鼠模型成功率高，并且操作简单，易于大量复制，便于对发病机制展开研究，尤其是疾病预防方面可以提供重要的帮助。然而UVB照射皮肤诱导的损伤取决于许多变量，包括波长、剂量、种族和皮肤组织特征[19]，想要建立与人类皮肤组织相似性高的SK模型，要求研究者对实验动物的挑选和紫外线剂量等方面进行严格控制。

2020年，Cheong等[20]发现暴露于紫外线部位的SK皮损中鸟嘌呤脱氨酶(guanine deaminase，GDA)高于正常皮肤，进一步研究了紫外线反复暴露下的角质形成细胞中GDA以及下游尿酸的表达，二者均升高，研究者推测鸟嘌呤脱氨酶以及下游尿酸上调可以产生活性氧导致DNA损伤，加速紫外线暴露下的SK细胞的衰老。这也说明SK细胞中或许存在与活性氧相关的氧化应激损伤。是否是紫外线造成的SK细胞中GDA升高和活性氧的产生有待研究。研究者可以以此为依据进行SK机制和模型的探索。

1.3 异种移植SK裸鼠模型 异种移植模型是指将患者的皮损移植到免疫缺陷的小鼠身上，是常见的造模方法。2012年，陈明等[21]将来自患者的SK组织块成功移植在BALB/c裸鼠背部。组织病理学检查显示皮损保留了人SK的组织特性。移植皮损存活最长时间为30天，平均21天。成功率75%。

该方法通过SK皮损移植，建立了与人类皮损相似的SK裸鼠模型，成功率高，适用于短期内活体研究SK的发病机制、评价SK药物疗效以及药物研发。但是，此类动物模型对移植物供体要求较高，制作移植皮损需要大量SK患者提供供体，不同供体之间存在遗传异质性，不适合大量复制研究。

2 细胞模型

2.1 原代细胞培养模型 原代细胞培养模型可以保留疾病组织源特性，常用的方法有组织块法、酶消化法、机械法。

2.1.1 黑素相关原代细胞模型 2013年Takenaka等[22]研究内皮素1和干细胞因子在脂溢性角化病的黑素细胞活化中的作用时，建立了SK原代细胞模型。研究者将SK组织灭菌、磷酸盐缓冲液冲洗后在0.1%的胰蛋白酶中37℃处理1小时，将SK组织分散成单个细胞。后700 g离心5分钟分离SK细胞，置于加入表皮生长因子和牛脑垂体提取物的154S培养基中培养。共进行了3次传代。

该方法成功培养了SK原代细胞模型，并进行了后续内皮素1和干细胞因子与SK细胞黑素形成的关系的一系列实验，为细胞模型的建立提供思路。此次实验中选取的SK皮损均为棘皮型和黑棘皮瘤型，其他病理类型是否能成功复制该方法还不清楚。而且本实验仅进行了3次传代，可能无法进行大量的实验研究。

2.1.2 蛋白激酶B通路相关原代细胞模型 蛋白激酶B又称Akt激酶，SK中常见的FGFR3突变和磷脂酰肌醇3激酶突变都可以激活Akt[23]。2016年Neel等[23]在研究SK中的Akt通路时，构建了SK细胞模型。研究者将SK皮损放入不含钙、镁的磷酸盐缓冲液中保存，后经过洗涤、消化，用镊子将皮损分离成小块，放入0.25%胰蛋白酶中消化组织分离细胞。1000 r/min离心5分钟，离心后重悬在含有适量MycoZap Plus-PR的角质形成细胞中，使用胶原蛋白覆盖平板，每天更换培养基。研究者称此方法可以至少传3代。

这次实验成功建立了SK细胞培养模型，并且进一步研究了Akt通路的持续激活与SK之间的关系，发现了Akt抑制剂和野生型P53对SK凋亡的作用，为Akt抑制剂对SK的治疗提供思路。但是后续没有类似研究证明此方法的可重复性。

3 小结

本文总结了目前国内外脂溢性角化病造模的方法。很多研究者根据SK的发病机制建立模型，其中转基因动物模型证据不足，紫外线诱导和异种移植模型较为可靠，然而紫外线诱导的模型成功的具体机制还不清楚，紫外线是SK发病的直接诱导因素还是间接诱导因素还有待研究。由于细胞模型具有实验目的单一，可控性强，便于观察等特点是其他模型不可替代的，而目前SK只有原代培养模型可供参考，因此今后SK细胞模型可以作为研究者攻克方向。此外，研究者可以采用多因素联合培养对造模方法进行改良。综上，研究者可根据自己的研究方向选择合适的造模方法。