病毒感染对细胞凋亡影响的研究进展

杨筱萌，罗语思，张科

1.贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室，现代病原生物学特色重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学附属医院急诊科

1972 年 Kerr 等[1]首次提出了细胞凋亡（apoptosis）的概念，宣告了对细胞凋亡探索的真正开始。细胞凋亡又称细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），是多细胞生物的一种生理性细胞死亡，是在个体发育过程中为维护机体内环境的稳定和调控机体发育，由基因编码的细胞程序性死亡过程，贯穿于机体整个生命活动过程，可由细胞内部和外部因素刺激所调控，可自然发生也可由病原微生物感染等外界因素诱导发生。

机体正常细胞凋亡存在复杂的调控机制，由多种凋亡诱导或凋亡抑制分子协同作用，分为内始式途径（intrinsic apoptosis pathway）和外始式途径（extrinsic apoptosis pathway）[2]。内始式途径即线粒体凋亡途径，主要通过细胞内在信号传导，引起线粒体跨膜电位去极化，导致促凋亡蛋白从线粒体膜间隙释放到胞质中，促进细胞凋亡发生。线粒体凋亡途径主要由B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）蛋白家族成员控制和调节。BCL-2 在细胞线粒体膜上表达，是一种明确的细胞存活促进整合膜蛋白。通过与B 细胞淋巴瘤/白血病x1 细胞（B cell lymphoma/leukemia-x1, Bcl-x1）结合，BCL-2 可抑制Caspase-9 活性从而抑制细胞色素C（cyto-chrome C,Cyt C）从线粒体释放到胞质，而Cyt C 进入胞质与Apaf-1 及Caspase-9 前体形成凋亡小体是引起细胞凋亡的关键[3]。BCL-2 不仅可通过稳定细胞线粒体膜通透性抑制宿主细胞凋亡，也可通过改变细胞线粒体膜通透性调节线粒体中Cyt C 的释放促进细胞凋亡，该过程包括钙离子过度进入、线粒体谷胱甘肽的氧化和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的增加等导致线粒体膜通道孔持续开放，造成线粒体膜电位的消失和Cyt C 的释放。BCL-2 蛋白家族成员Puma 通过上调促凋亡因子Bax表达引起线粒体膜电位下降，Cyt C 释放促进细胞凋亡；另一成员佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白 1（phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1,PMAIP 1）可引起Caspase-9 活化促进细胞凋亡[4]。外始式途径是通过肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体家族（如CD95）的受体与配体结合开始的，这些配体有TNF、由T细胞分泌的Fas 配体（Fas Ligand, FasL)等。在 Fas 偶联死亡区域蛋白（fas-associated death domain protein, FADD）的协助下，受体不断在细胞质中收集半胱天冬酶原8（procaspase-8）。自身激活的 Caspase-8 将会引发Caspase 级联反应诱导细胞凋亡[5-6]。因此，可将BCL-2 的表达下调、Cyt C 的释放以及 Caspase-9 的激活作为内始式途径发生的标志性事件加以检测，而将Caspase-8 的激活作为外始式途径发生的标志性事件加以检测，从而确定细胞凋亡由哪一种途径主导[7]。

病毒是一类体积非常微小、结构极其简单、性质十分特殊的微生命体，以其简单的结构、特殊的增殖方式和绝对的细胞内寄生等特征显著区别于其他生命体[8]。在细胞外，病毒以具有感染性的病毒粒子存在，但既不生长，也不能以分裂方式进行繁殖；在细胞内，病毒具有繁殖性，利用宿主细胞的生物合成机制，合成子代病毒基因组和病毒蛋白，装配子代病毒并释放至胞外[9]。越来越多资料表明，病毒感染与细胞凋亡密切关联[10-12]。病毒感染宿主细胞后，一方面宿主细胞可利用细胞凋亡来清除被病毒感染的细胞，加速感染细胞的死亡，继而限制病毒复制和传播，受病毒感染细胞的细胞凋亡可由病毒特异性的细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介导，也可在无外界信号刺激情况下自发产生，是机体针对病毒入侵而采取的防御机制之一；另一方面，为了复制遗传物质和生成子代病毒，某些病毒可通过抑制宿主细胞相关基因的表达和相应蛋白的合成，迟滞被感染细胞细胞凋亡的发生，使病毒顺利完成复制周期，从而产生大量子代病毒，这将有助于子代病毒传播，是病毒针对宿主细胞胞内微环境而进化出的生存机制之一。

病毒可通过直接或间接的方式影响细胞凋亡，达到其繁殖和扩散的目的，而病毒感染细胞后是诱导或抑制细胞凋亡，取决于多方面因素。本综述主要聚焦于病毒感染与细胞凋亡的相互关系，从细胞程序性死亡角度探讨病毒感染性疾病的发病机制，以期为深入研究病毒侵染和致病机理提供更多信息。

1 病毒感染诱导细胞凋亡

病毒感染细胞后，引起靶细胞凋亡主要有两种形式：①通过免疫系统介导；②通过病毒自身蛋白直接诱导靶细胞凋亡，或病毒编码的产物能诱导凋亡基因的表达等方式间接诱导靶细胞凋亡[13]。见图1。

图1 病毒感染诱导细胞凋亡的三种方式

病毒感染细胞后，静息状态的CTL 被抗原提呈细胞所激活，扩增分化为效应细胞，监视机体并清除感染。CTL 主要通过两种效应机制诱导细胞凋亡[14]，以此清除受病毒感染的细胞。一是通过分泌穿孔素（perforin），与细胞膜结合并在细胞膜上“钻孔”。为实现“钻孔”，CTL的T细胞受体首先必须能识别目标细胞，然后CTL 上的黏附分子将靶细胞紧紧地固定住，随后CTL 将穿孔素和一种称为颗粒酶B（granzyme B, GrB）的混合物输送到靶细胞表面。穿孔素可破坏靶细胞的外膜，当靶细胞试图修复这种损伤时，GrB 和穿孔素就可通过由靶细胞膜制成的囊泡进入细胞。被囊泡包裹进入靶细胞后，穿孔素分子即可在囊泡膜上凿孔，使GrB 被释放到靶细胞的细胞质中，GrB 可触发酶链反应，导致细胞凋亡。二是由CTL大量表达FasL，FasL与靶细胞受体Fas结合，启动靶细胞死亡受体-配体凋亡途径，导致携带Fas 的靶细胞凋亡。通过以上两种机制，机体在诱导病毒感染细胞凋亡的同时，清除入侵的病毒。早期有学者对呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）感染致细支气管炎患儿的鼻咽抽吸物和外周血的中性粒细胞凋亡进行研究[15]，通过流式细胞仪联合Annexin V 凋亡检测试剂盒检测抗CD95（Fas）单克隆抗体发现，RSV 感染组细胞凋亡率明显高于对照组，说明RSV 感染或可导致中性粒细胞通过Fas/FasL 途径加速凋亡，从而干扰机体免疫。O'donnell 等[16]发现 RSV 感染 A549 细胞后，可激活Fas 启动子，促进Fas 基因表达上调，致使细胞表面的Fas 表达升高，诱导凋亡发生。Nichols 等[17]在探讨甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）感染导致白细胞减少症的可能机制中发现，感染IAV 后淋巴细胞亚群中的CD4+、CD8+和CD19+淋巴细胞均发生细胞凋亡，且在凋亡细胞表面呈现Fas 高表达，非凋亡细胞表面则为Fas 低表达，并且在感染后细胞中加入 FasL 抗体、Ac-DEVD-CHO（caspase-3 抑制剂）或Z-VAD-FMK（一般caspase 抑制剂）后，细胞凋亡明显减少，说明Fas-FasL 信号通路在IAV 诱导淋巴细胞凋亡中起重要作用。同时，有相关报道认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）[18-19]、猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）也可通过Fas/FasL 途径诱导细胞凋亡[20]。SARS 患者外周血中淋巴细胞明显减少，特别是T 淋巴细胞，这也与T 细胞表面 Fas 高表达相关[18-19，21]。有学者用 IAV 经鼻感染穿孔素基因敲除小鼠后发现，穿孔素基因缺乏导致流感病毒在小鼠肺内大量增殖，小鼠清除病毒感染细胞所需的时间延长，并且病毒感染细胞发生凋亡的时间亦因穿孔素的缺乏而延迟，说明此株病毒依赖穿孔素促进细胞凋亡，并以此控制了病毒的增殖[22]。

病毒可通过蛋白表达直接促进靶细胞凋亡。有研究表明人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）侵袭后，CD4+T 淋巴细胞的不断减少与细胞凋亡直接相关[23]。HIV 包膜蛋白gp120与CD4+T 淋巴细胞表面的CD4 分子结合，促进HIV进入细胞，gp120 从病毒膜上脱落并大量积聚在淋巴组织中，通过CD4 分子活化信号途径诱导CD4+T淋巴细胞发生凋亡，导致该细胞减少，引起以CD4+T淋巴细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷[24]。HIV 的病毒蛋白 R（viral protein regulatory,Vpr）[25]、鼠细小病毒的非结构蛋白 1（non-structural protein 1, NS1）[26]均可造成细胞周期 G2 期阻滞，诱导细胞凋亡。HBV X 蛋白（hepatitis B virus X protein,HBVX）是由HBVX基因编码的一种多功能蛋白，它同样能够诱导细胞凋亡[27]，如HBV X 蛋白促进IL-18 mRNA 转录和表达，进而促进Fas/FasL 的表达而导致细胞凋亡[28]，还可激活线粒体/Cyt C 凋亡途径[29]。SARS 病毒M 蛋白通过上调钙浓度而增加线粒体膜通透性，当线粒体外膜被损坏后，位于线粒体内膜上的凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）被钙依赖性钙蛋白酶裂解释放到胞质，进入胞核中，裂解激活的AIF 具有切割DNA 的功能，使细胞DNA片段化，促使细胞凋亡[30-33]。猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的非结构蛋白Nsp4 和Nsp10 通过不同机制促进宿主细胞凋亡[34]。早期有研究表明，SARS-CoV Spike 蛋白及其主要片段S318-510 可以在早期通过抑制胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）1/2 信号通路诱导非洲绿猴肾细胞（Vero-E6 细胞）的凋亡[35]。席卷全球的SARS-CoV-2 ORF3a 蛋白可通过级联激活的Caspase-8 裂解Bid 蛋白，使之形成截断型的tBid 进入线粒体促进Cyt C 释放，诱导Vero 细胞发生细胞凋亡[36]。也有研究表明SARS-CoV-2 通过上调细胞内ROS 水平抑制PI3K/AKT/mTOR 通路，诱导细胞凋亡[37]。

病毒还可通过编码产物诱导凋亡基因表达间接诱导靶细胞凋亡。Takeuchi 等[38]研究呼吸道合胞病毒对正常新生儿单核细胞白细胞介素-1β（IL-1β）表达的影响时发现，RSV Long 毒株感染A549 细胞4 小时后，即可引起细胞中促凋亡基因感染素调节因子（interferon regulatory facto 1, IRF-1）基因表达的上调。Hsu 等[39]报道在人细小病毒B19 感染的红细胞中，NS1 通过招募细胞线粒体死亡蛋白Bax 和Bad，上调caspase-3和caspase-9蛋白活性，诱导细胞凋亡。p53 是人体抑癌基因，其产物主要存在于细胞核内，积累时可阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，维持基因组稳定，如腺病毒（adenovirus,AV）的E1A 蛋白能提高细胞中p53 水平从而诱导细胞凋亡[40]。不过也有研究表明AV 的E1A 蛋白有抑制细胞凋亡作用[41]。Devireddy 等[42]研究发现，牛单纯疱疹病毒Ⅰ型感染外周血单核细胞后p53 数量和活性明显增高。袁钧瑛等[43]首次发现SARS-CoV-2的RNA依赖性RNA聚合酶NSP12（冠状病毒复制和转录机制的高度保守的核心成分）促进了受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1）的激活，而RIPK1的激活可以通过介导caspase-8的激活促进细胞凋亡，并推测抑制RIPK1 可能为治疗重症COVID-19提供一种治疗选择。

2 病毒感染抑制细胞凋亡

在长期进化后，一些病毒为在宿主体内长期生存，可通过多种途径干扰机体介导感染的细胞凋亡作用，并有利于其自身在宿主体内长期潜伏。不同病毒抑制细胞凋亡的机制不同。病毒可以促进宿主细胞编码抑凋亡蛋白以阻断凋亡信号的转导，或者通过启动宿主的抗凋亡机制阻止或者延迟病毒感染的细胞发生凋亡。

文献报道B3 型柯萨奇病毒感染细胞后可激活PI3K/AKT 信号通路，启动核糖体合成蛋白，促进病毒复制，同时激活NF-κB 通路，提高宿主细胞存活率，显著抑制Caspase-9 活化和Caspase-3 的自我裂解，进而抑制细胞凋亡，为病毒复制和子代病毒释放提供更多载体[44]。Domachowske等[45]报道RSV可上调抗凋亡基因直接早应答因子3（immediate early response 3, IEX-1L）的表达从而抑制由 TNF-α 导致的细胞凋亡，HEp-2细胞感染RSV-B毒株后，表现为HEp-2 细 胞 IEX-1L 基 因 表 达 上 调 ，RNA 印 记 法（Northern blot）显示细胞内IEX-1L 基因水平上升至7 倍。Kotelkin 等[46]还发现 RSV 可依赖抗凋亡基因Mcl-1 表达的上调，延迟被感染细胞发生细胞凋亡。IEX-1L 和Mcl-1 与抗细胞凋亡蛋白BCL-2 同源，均具有抑制细胞凋亡的作用。还有一些病毒可通过加强宿主细胞BCL-2表达或自身表达出BCL-2同型异构体抑制细胞凋亡，如EB 病毒编码的BARF-1 蛋白[47-48]、腺病毒编码的 E1B-19k 蛋白[49]等均是BCL-2 的同型异构体。并且E1B-19K 不仅具有与BCL-2 相同的抗凋亡机制，还可与两种重要的促凋亡因子Bax 和Bak 结合以及阻止Cyt C 自线粒体 释 放[50-51]。Karl 等[52]实验证实以 PI3K 抑 制 剂LY294002 预处理的RSV 感染组细胞凋亡发生率明显高于LY294002 预处理对照组、空白对照组和RSV 感染组，凋亡发生率分别为19.86%、2.93%、0.08%和0.37%。故认为RSV 感染可抑制宿主细胞凋亡的提前发生，是通过激活PI3K/AKT 信号传导路径所致。另上文中提到的HBV X蛋白，可通过多种途径抑制细胞凋亡，如以p53 基因非依赖性调控[53]、细胞周期调节[54]以及Caspase-3活性抑制[55]等。

3 结语与展望

综上所述，同一科病毒的不同分离株或者是同一株病毒感染不同细胞系，对宿主细胞凋亡的影响都可能有所差异，这表明病毒感染细胞后对凋亡过程的调控具有特异性和复杂性。病毒对宿主细胞凋亡的调控并不是绝对诱导或绝对抑制，而是在不同感染时间段精准有序的调控，抑制细胞凋亡可为病毒复制和子代病毒释放提供更多载体，诱导细胞凋亡可及时引导巨量子代病毒释放。因此，从大多数病毒感染进程看，细胞凋亡可能遵循“先抑后扬”的规律。细胞凋亡是病毒与宿主共同作用的一种复杂的过程，病毒感染引起宿主细胞的凋亡对病毒的复制有消极或积极的影响。就宿主细胞而言，宿主会进化出识别病毒感染机制，当宿主细胞受到外界刺激，为了应对这种刺激而发生凋亡以清除感染，即宿主细胞通过主动性凋亡抑制病毒复制。就病毒而言，一方面病毒可以利用细胞凋亡释放和传播子代病毒粒子[26]，也可以利用凋亡过程中激活的Caspase 来促进自身繁殖，病毒会利用Caspase 促进病毒成分的核质转移，帮助病毒编码蛋白的转录和修饰，或者帮助病毒粒子的成熟组装[57]；另一方面病毒为了自身的繁殖也会抑制宿主细胞凋亡[56-57]。有关病毒对细胞凋亡调控机制的研究对指导临床的抗病毒措施有重要意义，同时对于探索细胞内的相关分子机制亦具有深远影响。