一种基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的靶向CD19 CAR-T细胞构建及抗白血病的功能研究①

张 灿 安志静 白 玥 王琛琛 钟晓松

（首都医科大学附属北京世纪坛医院临床基因与细胞工程中心，北京 100038）

近年来，嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor，CAR-T）免疫疗法在治疗恶性血液肿瘤中具有显著疗效，特别是在治疗急性淋巴细胞白血病中，完全缓解率可达到70%～90%，但大部分靶向CD19的CAR-T细胞（CART19）临床试验均有较高的复发率，这与CAR-T细胞在体内持续性短密切相关，而造成持续性短的主要原因是CAR分子结构的问题，CAR的结构主要包括4部分，分别是抗原结合域（scFv）、铰链区（间隔区）、跨膜区以及胞内信号区［1-3］。有文献报道转染含有4-1BB共刺激域的CAR-T细胞在体内存在时间长，并且采用突变型IgG4长铰链区可以延长T细胞的体内抗肿瘤作用［4-5］。因此，本课题组构建了一种基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的CAR，并在体内外验证其功能。

1 材料与方法

1.1 材料 K562、NALM-6和PG-13细胞系购自ATCC公司。NGFR-K562、CD19-K562和NALM6-GL细胞均由实验室构建，方法参考文献［6］。所有细胞系支原体检测均为阴性；RPMI1640培养基和DMEM培养基购自Lonza公司；淋巴细胞分离液购自美国MP公司；PHA购自Sigma公司；胎牛血清购自Thermo公司；重组人IL-2购自双鹭药业；所有流式抗体均购自美国BD公司；IFN-γELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；D-虫荧光素钾盐购自桥生物公司；SPF级NOD/SCID小鼠购自北京维通利华实验动物技术公司，饲养于首都医科大学附属北京世纪坛医院的SPF级动物房，实验动物所有操作程序均由实验动物伦理委员会批准。逆转录病毒质粒及包装体系均为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激因子CAR的逆转录病毒的构建和包装 本实验室前期构建了MSGV-FMC63-28Z质粒，设计突变的IgG4长片段来源的铰链区及4-1BB共刺激域对CAR结构进行改造，采用PG-13病毒包装体系制备逆转录病毒，高速离心后-80℃保存［6-8］。以空质粒包装的逆转录病毒载体作为对照病毒Mock组。

1.2.2 CART19细胞的制备 采集多位健康志愿者外周血，经淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞（PBMC），采用PHA刺激活化T细胞［9］。经逆转录病毒转导，次日换含有IL-2的完全培养基进行CART细胞扩增，在转导后4 d采用流式细胞仪检测病毒转导效率，并用Western blot验证是否表达外源性

CD3ζ［6］。

1.2.3 肿瘤细胞对CART19细胞的特异性激活

1.2.3.1 IFN-γ胞内染色 按照效靶比10∶1将效应细胞（CART19细胞）与肿瘤细胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培养，期间加入1µl的Golgi Stop，6 h后收集细胞，按照IFN-γ胞内染色标准流程进行流式检测。

1.2.3.2 CD107a脱颗粒实验 按照效靶比10∶1将效应细胞（CART19细胞）与肿瘤细胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培养，期间加入1µl CD107a抗体和1µl的Golgi Stop，6 h后收集细胞，染色CD3、CD4和CD8后进行流式细胞仪检测。

1.2.3.3 CFSE增殖实验 在第0天将CART19用PBS清洗后进行1µmol/L CFSE荧光染色20 min，再用含有2%FBS的PBS终止染色，PBS清洗2遍后流式检测初始荧光值，按照效靶比2∶1将CART19和NALM6-GL和K562分别避光共培养4 d，收集细胞流式检测。

1.2.4 评估CART19细胞对肿瘤细胞的杀伤能力和细胞因子释放能力

1.2.4.1 4 h共培养荧光杀伤实验 按照效靶比10∶1将效应细胞（NT、Mock和CART19细胞）与肿瘤细胞（NALM6-GL）共培养4 h，加入D-虫荧光素钾稀释至150µg/ml，采用Xenogen IVIS成像系统进行荧光拍照，杀伤率基于孔中的肿瘤细胞的荧光值，计算公式：杀伤率（%）=100-（效应细胞和靶细胞共培养荧光值/靶细胞荧光值）×100%。

1.2.4.2 ELISA法检测IFN-γ释放 按照效靶比10∶1将效应细胞（NT、Mock和CART19细胞）与肿瘤细胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培养24 h，收集上清离心后，用ELISA标准方法检测IFN-γ的分泌量。

1.2.5 体内实验评价CART19细胞的抗肿瘤能力 6周龄雌性NOD/SCID小鼠尾静脉注射1×106个的NALM6-GL细胞建立急性淋巴细胞白血病小鼠模型，于建模第2～4天连续3 d注射Mock细胞和CART19细胞5×106个/次，每组3只，每周采用Xenogen IVIS成像系统进行荧光拍照，并计算生存率。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 5软件进行数据统计，数据以±s表示，每组实验至少独立重复3次，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 载体构建、病毒包装及转导效率评估 采用鼠源CD19 scFv、突变型IgG4铰链区、CD28跨膜域和胞内活化信号4-1BB以及CD3ζ构建了逆转录病毒载体质粒（图1A）。采用制备的CART19逆转录病毒及对照组病毒转染活化的T细胞，流式细胞仪检测转染效率分别为20.60%和1.43%（图1B）。Western blot检测转染细胞人源CD3ζ的表达，结果显示，与NT和Mock组相比，CART19组外源性CD3ζ的表达显著（图1C）。

图1 CART19的设计及转导T细胞的表达Fig.1 CART19 design and expression in transduced T cells

2.2 CART19可特异性识别CD19+肿瘤细胞并表达IFN-γ、脱颗粒 流式细胞仪检测CART19细胞的IFN-γ和CD107a的表达，结果显示与CD19-细胞系共培养相比，CD19+细胞系可以明显刺激T细胞表达IFN-γ以及发生脱颗粒（图2A、B）。通过流式细胞仪检测CART19细胞的CFSE表达，结果显示与CD19-细胞系共培养相比，CD19+细胞系可以明显刺激T细胞增殖（图2C）。

图2 CD19特异性刺激CART19细胞表达IFN-γ和CD107aFig.2 CD19 specifically stimulates expression of IFN-γand CD107a in CART19 cells

2.3 CART19细胞可以特异性杀伤CD19+肿瘤细胞并释放IFN-γ 按照不同效靶比（E∶T）将效应细胞同NALM6-GL共培养4 h，结果显示随着效靶比的不断增加，CART19对靶细胞的杀伤逐渐增强，而NT及Mock T细胞组无明显变化（图3A）。在此选取效靶比10∶1进行24 h的共培养，收取培养上清液进行IFN-γ的ELISA检测，结果显示在靶细胞为NALM6-GL的共培养中，CART19组的IFN-γ的释放明显高于NT组和Mock组，在靶细胞为K562-CD19的共培养中，CART19组的IFN-γ的释放也明显高于NT组和Mock组，差异具有统计学意义（P＜0.001，图3B）。

2.4 CART19细胞在急性淋巴白血病小鼠中的抗肿瘤作用 为了评估CART19在体内的功能，采用NALM6-GL尾静脉注射建立急性淋巴细胞白血病的小鼠模型（图4A）。与Mock组相比，注射CART19细胞组的小鼠肿瘤负荷明显减轻（图4B），Mock组小鼠在35 d内全部死亡，而CART19细胞组小鼠在44 d均存活，CART19细胞组的生存率也明显提升（图4C）。结果显示构建的CART19在体内具有明显的抗肿瘤作用。

图4 CART19细胞在体内表现出显著的抗白血病效应Fig.4 CART19 cells display significant antileukemic activity in vivo

3 讨论

CAR-T免疫疗法在治疗血液系统恶性肿瘤特别是B细胞恶性肿瘤已经取得成果［10-11］，经过治疗70%～90%的B系急性淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者可以达到完全缓解，然而随着更多长期随访数据的公布，CAR-T治疗后的高复发率也成为CAR-T发展的最大障碍，其中CD19 CAR-T细胞在体内缺乏持久性是造成CD19+阳性复发的重要原因［1-2］。TURTLE等［12］研究发现，CD19+阳性复发仅发生在没有持续性CAR-T细胞的患者中，因此提高CAR-T细胞在体内的持续性是降低CD19+复发的重要手段之一。CAR结构中与CAR-T细胞在体内持久性关联较多的研究是共刺激域部分，CD28和4-1BB是目前研究最多的两种共刺激域分子，多项研究表明，相比于CD28，含有4-1BB共刺激域的CAR-T细胞在体内存活时间更长［4，13］。CD19-28ζ的CAR-T细胞在体内的中位存活时间是3个月，而有68%CD19-BBζCAR-T细胞超过了6个月，最长高达20个月，因此在CAR结构设计重点是含有4-1BB对维持CAR-T在体内的持续性［14-16］。

另外研究不多的铰链区结构对CAR-T细胞的功能也有十分重要的作用［17］。有研究表明来源于突变型的IgG4长铰链区可以促进抗肿瘤作用，首先IgG4与高亲和力受体FcγR1（CD64）的结合力较低，其次长片段可以增强单链可变区（scFv）的灵活性从而缓解CAR与肿瘤抗原的空间限制，进而促进CAR-T细胞和靶细胞之间免疫突触形成［5，18］。采用突变型的IgG4长铰链区可以在不改变CAR介导的抗原裂解的同时降低与Fc-γ受体的结合，从而消除脱靶效应，进一步提高T细胞的持久性和抗肿瘤反应［7］。具体的突变位点是在IgG4铰链区的CH2部分中含有2个突变点L235E和N297Q，而且这种突变既不会影响CAR的表达也不会改变CAR-T细胞对CD19+肿瘤细胞的特异性杀伤［7］。

构建这种基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的CAR，经过逆转录病毒包装、转导和扩增，获得了CART19细胞。体外实验证明了CART19细胞可以有效杀伤CD19+肿瘤细胞并分泌大量IFN-γ，并且CD19+肿瘤细胞也可以特异性刺激CART19细胞表达IFN-γ、脱颗粒以及促进增殖，体内实验也证明CART19细胞具有抗肿瘤作用并且可以延长白血病小鼠的生存率。

除了共刺激域和铰链区，CAR的结构中研究较多的还有scFv，有研究表明降低scFv亲和力会提高CAR-T细胞活化的阈值，避免过度活化从而保持记忆表型，使CAR-T细胞能够长期存活［19］；鼠源scFv的免疫原性可能会导致CAR-T细胞在体内无法持续存活，而人源化的scFv可以降低人体对CAR产生的免疫应答，有望延长CAR-T在体内的存活时间，因此本课题组可以继续改进CAR的结构，提高CAR-T在体内的持续性，从而降低疾病复发［12］。

目前，除了改变CAR结构提高CAR-T细胞在体内持续性之外，还可通过制备来源于记忆性干细胞样T细胞（memory stem cell T cells，Tscm）的CAR-T细胞也是提高CAR-T细胞在体内的持续性的重要方法之一。Tscm细胞不仅具有干细胞特性，还可在体外分化成中央记忆性T细胞（central memory T cell，Tcm）和效应记忆性T细胞（effector memory Tcell，Tem），提高自我更新、增殖和存活能力［20-21］，更重要的是CD19CAR修饰的Tscm细胞还具有强大而持久的抗肿瘤能力［22］，因此选择Tscm细胞作为来源制备CAR-T细胞以增强其持久性和杀伤性。

本研究成功构建了基于突变型IgG4长铰链区和4-1BB共刺激域的CAR-T细胞，为进一步研究CAR-T细胞在体内存活的机制及下一步临床试验奠定了基础。